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1、荧光共振能量转移FRET陈同生J华南师范大学信点光电子科技学院丿包翁电子能级、振动能级和转动。分子能级与荧光子的I1J能状态是个连续的,大此各状态对卅能螢tt显卖的2荧光(Fluorescence)：当处于基态的分子吸收光能后进入激发态，并且立即返回基态并以 光*J形式释放能量，这种光称为荧光。4.3磷光(Phosphorescence):分子从激发三线态返回基态以光的形式释放能量。 '敷发(Excitation, Ex)和发射(Emission, Em)光谱(Spectra):Fluorescence SpectraStoker ShiftCy3荧光共振能量转移(FRET)现象1 供
2、体(Donor, D)2. 受体(Acceptor, A)3. FRET现象的特征：选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光Em. 470nmDonorEm. 535nmCFPEx. 470nmAcceptorEx. 440nmFRET 原理(Principle)Acceptor (YFP)Don orf luoresice-nce!FRETfluor-esc-ence2、1 -E= 代/?o+7?6局:&50%时供体和受体分子间的距离.对于特定 的供体受体对是常数；R：供体和受体分子间的距离.E: FRET效率.对于用寺别灵破450500 550600 九(nm)3、供体分子的发射态
3、偶极矩与受体分 子的吸收态偶极矩、以及它们的向量 必须满足一定的条件1X)NORACCEPTOREnergy Transfer EfficiencyE=!rj屮Rg1=50% transfer efficiency distance3nm7nmuSpect roscopic Ruler*00 A.© © Jk1、供体分子的发射光谱和受体分子的吸收 光谱必须有显著的重迭，一般大于30%； 供体分子和受体分子间的距离必须在10 run之间.D和A间的FRET效率:通过FRET技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息。 常用于解决如下问题：1）蛋白分子的共定位;2）蛋白
4、分子聚合体；3）转录机制；4）转换途径；5）分子运动;6）蛋白折叠等生物学问题.FRET技术应用一:检测两个发光分子间的重合与共定LaserLaser利用FRET技术检测不发光分子间相互作用的策略AcceptorLabe led Protei nsFRET技术应用二:检测分子间的相互作用IntermohcularFRETProtein A Protein BProtein-protein complexProtein A Protein BProtein-protein complexLaserProtein A Protein BProtein-protein complexFRET技术应用
5、三:检测分子的折叠与构象变FRET技术应用举例：细胞内钙离子浓度的实时测量490 nm(b)Miyawaki A, et al., Nature 1997, 388:882-887在FRET实验中经常使用的/4-t /-Jr- TT7 /-Jr-d±T %|/ / Dye)供体-支1耶灾尤分十河FITC-Rhodam i neAl exa488Cy3Cy3-Cy5 绿色荧光蛋白类(reen luorescent roteins, 3FPs)BFP-GFPBFP-YFPCFP-YFPCFP-dsREDGFP-dsRED参考阅读文献1. Jonathan D. Violin,et al.
6、, A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C. J Cell Biology, 2003,161:899-9092. Elizabeth A J et 1., FRET Imaging. Nature Biotechnology, 2003,21:13887-13953.4.5.6.Rajesh B S. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of
7、live cell protein localizations. J Cell Biology. 2003, 160: 629-633Jin Zhang, et al.,. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. PNAS ,2001, 9& 14997-15002Michael G. Erickson, et al., DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP. Bioph
8、ysical Journal, 2003,85:599-611Alexander Sorkin, et al., Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy Current Biology 2000,10:1395-13981. 为什么FRET效率对供体受体分子间的空间距离非 常灵敏？2. 你认为FRET技术特别适合什么领域?举例说明。3. A和B分子都不能发射荧光，要求采用FRET技术检 测二者之间的相互作用特征，请问应该如何处理？论文题目: