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1、总RNA提纯试剂盒操作步骤1准备估算Redzol或组织细胞的用量。每1ml Redzol的组织用量为50100mg 细胞用量为510X 106个细胞2. 组织或细胞的裂解 贴壁细胞吸尽培养液，加入 Redzol，用移液器反复吹打数次，确保全部裂解，然后 转移至新的离心管中。裂解10cm细胞需要1ml Redzol。注：Redzol的加入量不是根据细胞数目来决定，而是根据细胞培养皿的面积（10cm/m）来决定。 悬浮细胞离心收集细胞，吸尽液体，加入 Redzol用移液器吹打数次，确保全部裂解（某些酵母和细菌要用匀浆器匀浆才能全部裂解），然后转移至新的离心管中。 按1ml Redzol可裂解510
2、X 106动物、植物、酵母细胞或 1X 107细菌细胞的比 例加入Redzol裂解细胞。注：应避免在Redzol加入前洗涤细胞，这样会增加 mRNA降解的几率。 组织先将新鲜组织剪成小块，放入匀浆器内，加入 Redzol用匀浆器匀浆，然后 转移至新的离心管中。或者将组织在液氮中研磨成粉末后，加入 Redzol中。每 50100mg的组织加入1ml Redzol进行裂解。注：样品总体积不要超过所用 Redzo体积的10%。3. 分相a. 将匀浆液1530C静置5分钟使其充分裂解。b. 每1ml Redzol中加入0.2ml的三氯甲烷（氯仿），震荡混匀后1530C静置 23分钟。c. 12,000
3、rpm 离心15分钟。离心后混合物分成三相（下面的酚/氯仿相、中间的白色界面、上面的无色水相）。RNA全部在无色的水相中。注：对于含有高浓度蛋白、脂肪、多糖或纤维素（肌肉、脂肪组织、植物的微管组织）的样品，在分相前可以附加一个分离步骤，匀浆后12,000rpn离心10分钟弃沉淀。RNA溶解在上清液中，纤维素、多糖、大分子量的 DNA以不溶的形式沉淀从而与RNA分离。对于脂肪组织的样品，上面一层脂肪组织可以被清除掉，将清澈的匀浆液转移到另一新管中，继续进行第 3步分相。4. 柱纯化a. 转移上层水相到另一新的1.5ml离心管中，加入200J无水乙醇，颠倒混匀。b. 将混合液吸入离心纯化柱（硅胶膜
4、）中，静置 3 分钟， 12,000rpm 离心 23分钟。c. 倒掉收集管中的废液，将离心纯化柱重又套入收集管中。加入600JRNA洗涤液， 12,000rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液。d. 12,000rpm 再离心 2 分钟，尽量除尽液体。将离心纯化柱套入干净的 1.5ml 离心管中，加入50 d DEPC处理的超纯水或0.5% SDS于离心纯化柱正中（不 要粘在管壁上），静置12分钟，12,000rpm离心1分钟。e. 将洗脱液吸入离心纯化柱中再洗脱一次，以提高RNA的回收量。洗脱下来的液体即是纯化的RNA -20 C保存。常见问题解答每 mg 组织或 106培养细胞的 R
5、NA 产率肝和脾610dg肾34dg骨骼肌和脑11.5 dg胎盘14dg上皮细胞58dg纤维原细胞57dgRNA产率低样品裂解或匀浆不完全；提取的 RNA溶解不完全A260/A 280< 1 . 6 5紫外检测时RNA羊品应用水稀释，不能用TE稀释，低盐离子溶液和低pH值溶液致使其在 280nm的吸收值增加（Wilfinger, W.et. al, Biotechniques 22: 474-481; Fox, D.K.（1998） Focus 20: 2 p.37 ）；样品匀浆时加入 Redzol 试剂 体积太少，匀浆后溶液分层不明显，水相被酚污染；最后提取的RNA羊品不能完 全溶解。RNA 降解使用的动物组织没有被立即冻上或放入 Redzol 中匀浆； 分离使用的样品或 制备的RNA长期贮存在-5-20 °C，而不是贮存在-60 C -70 C；提取RNA的细胞 被胰蛋白酶分解，易导致提取的RNA降解；水相或使用的离心管仍残留有 RNase 变性凝胶电泳使用的甲醛pH值低于3.5。分离使用的样品含有有机溶剂 （乙醇， DMSODNA 污染 样品匀浆时加入试剂体积太少； 等），盐离子或碱溶液。