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1、丙泊酚对小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的影响胰岛素抵抗在危重病人中十分常见 , 严重影响危重病人的预后。丙泊酚可引 起大鼠胰岛素抵抗 , 但具体机制尚不清楚。为了从分子水平探讨丙泊酚影响肝脏胰岛素抵抗的机制 , 本研究以正常培养 的小鼠原代肝细胞及TNF-a诱导产生胰岛素抵抗的小鼠原代肝细胞为研究对象，检测丙泊酚对胰岛素信号通路关键酶磷酸化水平和细胞内糖原水平的影响 , 结果 显示 , 丙泊酚可显著降低正常培养小鼠原代肝细胞 Akt(Ser473) 和 GSK-3p(Ser9) 的磷酸化水平,抑制PI3K/Akt/GSK-3 B信号通路,抑制肝细胞糖原合成,从而引 起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗。对于
2、TNF-a诱导产生胰岛素抵抗的小鼠原代肝 细胞,丙泊酚预处理可缓解TNF-a对小鼠原代肝细胞PI3K/Akt/GSK-3 B信号通 路及糖原合成的抑制，提示丙泊酚对TNF-a导致的小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗 有保护作用。在大多数手术、 创伤和危重病 (如烧伤、脓毒血症 )中胰岛素抵抗是常见的一 种代谢紊乱 , 并伴有高血糖。在危重病人 ( 特别是手术病人 ) 中, 高血糖伴随着死亡 率上升、易感性增加、多发性神经病变、肾功能不全、输血需求增加、机械通气 时间延长、入住ICU需求增加和住院时间延长。有研究说明 , 通过胰岛素强化治疗来严格控制血糖可降低创伤感染的风险并 降低 ICU 病人的发病率和
3、死亡率；虽然也有与之有争议的结果报道 , 但至少可以 推测这些有争议的结果局部是由于胰岛素强化治疗所引发严重低血糖的机率增 高所致。有研究发现 , 丙泊酚麻醉可引起大鼠显著的全身性胰岛素抵抗 , 在丙泊酚 麻醉大鼠的骨骼肌和心肌组织中由胰岛素引起的葡萄糖摄取减少 , 肝糖输出增加 ,结果说明在肌肉中由胰岛素引起的葡萄糖摄取减弱及肝糖输出抑制受损与丙泊 酚引起的全身性胰岛素抵抗有关。丙泊酚是目前最常用的静脉麻醉药 , 不仅用于各种手术的麻醉诱导和麻醉维 持,而且还用于ICU病人的长时间镇静。丙泊酚在临床上广泛用于或未知患 有胰岛素抵抗的病人 , 但是排除手术应激及脂溶性载体等因素 , 单独应用丙
4、泊酚 对胰岛素信号通路及胰岛素抵抗的影响尚无深入研究。丙泊酚是否会加重危重病人的胰岛素抵抗 ?发生胰岛素抵抗的危重病人输注 丙泊酚是否平安 ?在本研究中 ,我们选取胰岛素作用的经典靶器官肝脏 ,同时也是 调控糖脂代谢最重要的脏器 , 观察丙泊酚对小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的影响 , 探讨丙泊酚影响肝脏胰岛素抵抗的分子机制 , 为针对性地预防和治疗危重病人胰 岛素抵抗提供更充分的科学依据 , 同时指导我们在临床麻醉工作中选择适宜的麻 醉方式和麻醉用药。 第一章丙泊酚可引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗目的探讨丙 泊酚对小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的影响。方法采用MTT法检测不同浓度丙泊酚培养条件下，小鼠原代
5、肝细胞活力的变 化。用终浓度为10卩g/ml的丙泊酚处理小鼠原代肝细胞 24h, Western blot 检 测PI3K/Akt/GSK-3 B信号通路,蒽酮法检测糖原合成。用终浓度为10卩g/ml的丙泊酚处理小鼠原代肝细胞 24h, Western blot 检 测PTEN蛋白含量,RT-PCR检测PTEN mRN表达。所有数据代表 3次独立重复实 验所得样本的均值。采用SPSS19.0统计学软件(SPSS Inc., Chicago, USA),计量资料以均数土标准差(斑s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析，多 重比较采用Tukey检验。方差不齐时采用 Welch
6、校正,多重比较采用Tamhan6 sT2检验P<0.05为差异有统计学意义。结果在一定浓度范围内(125卩g/ml丙泊 酚对小鼠原代肝细胞活性无显著影响 , 但随着丙泊酚浓度增高 , 小鼠原代肝细胞 活性逐渐下降。当丙泊酚终浓度到达100卩g/ml时，小鼠原代肝细胞活性下降至对照组的 35 ± 5%(P=0.000)。在明确不同浓度丙泊酚对小鼠原代肝细胞活力的影响后,根据实验结果并结合临床及相关文献，选取10卩g/ml丙泊酚终浓度，检测不同培养时间 下丙泊酚对小鼠原代肝细胞活力的影响，结果显示培养32h后，小鼠原代肝细胞 活力无显著变化 (P=0.949,F=0.216
7、) 。丙泊酚处理后pAkt(Ser473)和pGSK-3j3 (Ser9)相对降低，糖原合成减少；用 丙泊酚(终浓度10卩g/m1)和LiCl (终浓度20卩mol/L)处理小鼠原代肝细胞 24h,Propofol+LiCI 组与DMS组相比较,两者在糖原合成上无显著差异 (P=0.649),在 pGSK-3B (Ser9)/GSK-3p 上无显著差异(P=0.079),但在 pAkt(Ser473)/Akt上两者差异有统计学意义(P=0.024)。丙泊酚处理后PTEh蛋 白表达升高(P=0.001), PTEN mRNA水平升高(P=0.026)。结论丙泊酚抑制小鼠原代肝细胞 PI3K/Ak
8、t/GSK-3 B信号通路。丙泊酚可引 起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗。GSK-3B (Ser9)磷酸化受到抑制是丙泊酚抑制小鼠原代肝细胞糖原合成的关键环节。丙泊酚引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的作用靶点在GSK-3B上游。丙泊酚从上游抑制了小鼠原代肝细胞 PI3K/Akt/GSK-3 B信号通路。第二章 PTENS因沉默可逆转丙泊酚引起的小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗目的探讨PTEh在丙泊酚所致小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗中所起的作用及所处的位置 , 为治疗丙泊 酚的不良反响寻找可能的干预靶点方法Cy3标记的siRNA转染小鼠原代肝细胞,用荧光显微镜观察其亚细胞分 布定位。在小鼠原代肝细胞中转染公司合成的三
9、段 siRNA24h,设计并筛选得到有 效干扰PTEN表达的siRNA片段。在小鼠原代肝细胞中同时参加丙泊酚(终浓度10gg/m1)和siR-996,培养24h, Western blot 检测 PI3K/Akt/GSK-3p 信号通路 , 蒽酮法检测糖原合成。所有数据 代表 3 次独立重复实验所得样本的均值。采用SPSS19.0统计学软件(SPSS Inc., Chicago, USA),计量资料以均数土标准差 (x ±s) 表示 , 两组间比较采用 t 检验 , 多组间比较采用单因素方差分析 , 多 重比较采用 Tukey 检验。方差不齐时采用 Welch 校正, 多重比较采用
10、Tamhane's T2检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果 Cy3标记的siRNA转染10min后,在 小鼠原代肝细胞中Cy3-siRNA的转染效率大于95%与negative control组比,siR-996能够最有效抑制PTEN表达,PTEN蛋白表 达降低至对照组的51 ± 5%(P=0.000), PTEN mRNA水平降低至对照组的 45+5%(P=0.000)。当 PTEN基因沉默后，siR-996+Propofol 组与 NC+DMS组相比 较，两者在糖原合成上无显著差异(P=0.967),在pGSK-3B (Ser9)/GSK-3 B上无
11、 显著差异 (P=0.846), 在 pAkt(Ser473)/Akt 上无显著差异 (P0.757) 。结论丙泊酚引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的作用靶点可能在PTEN或其上游。第三章丙泊酚对TNF-a导致的小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗有保护作用目的 观察丙泊酚对TNF-a导致的小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的影响，探讨丙泊酚影 响肝脏胰岛素抵抗的机制。方法用终浓度为10ng/ml的TNF-a处理小鼠原代肝细胞24h, Western blot 检测PI3K/AKT/GSK-3B信号通路,蒽酮法检测糖原合成。用终浓度为10gg/ml的 丙泊酚处理小鼠原代肝细胞6h,然后参加终浓度为10ng/ml的TNF
12、-a处理小鼠原 代肝细胞 24h,Western blot 检测 PI3K/Akt/GSK-3p 信号通路 , 蒽酮法检测糖原合 成。所有数据代表3次独立重复实验所得样本的均值。采用 SPSS19.0统计学软 件(SPSS Inc., Chicago, USA), 计量资料以均数土标准差(x ± s)表示，两组间比 较采用 t 检验, 多组间比较采用单因素方差分析 , 多重比较采用 Tukey 检验。方差不齐时采用 Welch校正,多重比较采用Tamhan6 s T2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。结果TNF-a处理24h后pAkt(Ser473)/Akt降低至
13、对照组的 45+12%(P=0.001),pGSK-3p(Ser9)/GSK-3(3 降低至对照组的 47±11%(P=0.001), 糖原合成减少至对照组的49+10%(P=0.001)。用终浓度为10卩g/ml的丙泊酚处 理小鼠原代肝细胞6h,然后参加终浓度为10ng/ml的TNF-a处理小鼠原代肝细胞 24h,Propofol+TNF- a 组在 PAkt(Ser473)/Akt、pGSK-3B (Ser9)/GSK-3 B 及糖原 合成上均高于 DMSO+TNF-组(P=0.000;P=0.002 ; P=0.031)。结论用TNF-a处理小鼠原代肝细胞，可成功构建胰岛素抵抗
14、的细胞模型。丙泊酚对TNF-a导致的小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗有保护作用，但这种保护作用 并不是通过直接作用于 PI3K-Akt 信号通路实现的。全文结论1、丙泊酚抑制小鼠原代肝细胞 PI3K/Akt/GSK-3 B信号通路,引起 小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗。 2、 GSK-3B (Ser9) 磷酸化受到抑制是丙泊酚抑制小 鼠原代肝细胞糖原合成的关键环节 , 丙泊酚引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的作 用靶点在GSK-3B上游。3、丙泊酚引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗的作用靶点可能在4、丙泊酚对TNF-a导致的小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗有保护作用PTEN或其上游。, 但这种保护作用并不是通过直接作用于 PI3K-Akt 信号通路实现的。