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1、叶绿素的测定步骤：1. 采集处理的新鲜叶片，擦净组织表面的污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2. 准确称取剪碎的新鲜样品0.2g,共3份。分别置于25ml的容量瓶中，用乙醇浸泡24小时。注意要避光保存。,95% (v/v):=133646«2=27.43A648.6=5.24H&2=1000470 一3. 摇匀，取提取液倒入比色杯中，在 665, 649, 470nm波长下测 定其消光度（OD值，以95叱醇为空白对照，按公式计算色 素浓度（mg/L）j 5J9A&8.6一 8 J24664.2+ 22.244648.62A3Cg - 97.64Q209Ca是叶绿素a的浓度
2、，Cb是叶绿素b的浓度，Ca+Cb是叶绿素总浓 度，Cx.c为类胡萝卜素的浓度。A665 A649 A470分别为叶绿体色素提取液在波长665, 649, 470nm下的消光度。叶绿素含量（mg/g）=（色素的浓度x提取液的体积x稀释倍数）/样品鲜重叶绿素含量：采用分光光度计法测定，所得值为单位质量叶片的含量。叶绿素总量：为单位质量叶片叶绿素含量乘以叶片鲜重叶片含水率=（鲜重-干重）/鲜重x 100%GS酶活性及可溶性蛋白的测定一、步骤：GS酶活性：1. 取冷冻小麦样品0.5g 样品置于预冷的研钵中。2. 加入少许石英砂研磨，加入 1.5ml 的 Tris-Hcl 缓冲液 （分两次加入）继续研
3、磨匀浆后倒入2ml 离心管中。3. 于4C, 13,000 r/min 离心20min,上清液即为粗酶液。4. 按照以下顺序向5ml 离心管中分别加入：0.6ml 咪唑 -盐酸缓冲液+0.4ml 谷氨酸钠+0.4mlATP-Na+0.2ml MgSO4+0.3ml 粗酶液+0.3mlTris-HCL 缓冲液。5. 于 25水浴5分钟， 加入 0.2ml 羟胺反应15分钟后， 加入 0.8mlFeCl3终止反应。6. 混合液于8000r/min离心8min后取上清液于540nm比色测定吸光值（对照用Tris-HCL 代替酶液）。可溶性蛋白：1 . 向 2ml 离心管中加入95uL Tris-HC
4、L 缓冲液，再加入5uL 测酶活时的上清液（即粗酶提取液），混匀，加入1mL Bradford 试剂，颠倒混匀反应3-5min。2 .测定反应液在595nm下的吸光值。（对照100uL Tris-HCL+1mLBradford 试剂） 。二、试剂配制1 100mmol/L、PH7.6 的 Tris-HCL 缓冲溶液把 6.057gTris 、 0.1016gMgcl 2、 0.1461gEDTA、 0.3520ml ?-巯基 已醇溶解后在500ml容量瓶中混合，加入去离子水 450ml,用1MHCL 调PH=7.6，最后用去离子水定溶到500ml。2 0.25mol/L 、PH7.0的咪噪一盐
5、酸缓冲液取4.255g咪噪于容量瓶中，加去离子水 200ml,用1M HCL PH=7.0,用去离子水定溶到250ml。3 0.3mol/L 、PH7.0的谷氨酸钠溶液称取5.6139g谷氨酸钠于100ml容量瓶中，加入去离子水80ml, 用1M HCL? PH=7.0,用去离子水定容到100ml。4 30mmol/L 、PH7.0 的 ATP-Na溶液1g ATP-Na于容量瓶，加入去离子水 45ml,用NaOHM PH=7.0, 再加入 5ml 去离子水。5 0.5mol/L 的 MgSOt液称取30.81g MgSOF 250ml容量瓶中，加入200ml去离子水使其充分溶解，后定容到25
6、0ml。6 羟胺试剂(1)1mol/L NH 2OH- HCL 3.4745g NH zOH.HCLffl去离子水定溶到50ml(2) 1mol/L NaOH 2.0g NaOH 用去离子水定溶到50ml使用前等体积混合即可7 FeCl 3试剂(1)0.2mol/LHCL 4.175mlHCL 用去离子水定溶250ml(2)10% (w/v) FeCk6HO 10g FeCl 3.6HO于 100ml 烧杯中，用 0.2mol/L HCL 溶解并定溶100ml。(3) 24% (w/v)三氯乙酸60g三氯乙酸，用蒸储水定溶 250ml(4) 50%(v/v)HCL 50mlHCl 用蒸馏水定溶
7、到100ml等体积混合(2) 、 (3) 、 (4) 三种溶液即可8 1mol/L HCL 20.875ml 浓 HCUt容到 250ml。9 Broadford 试剂:50mg考马斯亮蓝 G-250,25mL95%J1,50mL85% 磷酸，定容至500mL贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。三、关于标准曲线制作标准曲线的丫 -谷氨酰异羟肪酸用量一般为1 5区mol之间，按照测定酶活的反应液总体积定容后，加入1mlFeCL3 试剂，在540nm处测定光密度，绘制标准曲线。谷氨酸脱氢酶(GDH活性测定：称取新鲜材料1.0 g于研钵中，加8 mL提取液(0.2 mmol L-1 , pH 8.2， Tris-HCl 缓冲液) 冰浴研磨，转移到 10 mL 离心管中，4 、20 000 r/min 离心 20 min， 上清液即为粗酶液。取1 mL 酶提取液加入2 mL反应液B （ 60即ol L-1 L-谷氨酸+1.6 gmol L-1NAD+0.36 mmol -L-1 Tris-HCl 缓冲液），以加反应液 A （1.6 mol L-1NAD+0.36 mmol -L-1 TrisHCl 缓冲液）为对照，于 340 nm 处比色，每隔 1 min 记录一次OD 值， 共记录 4 次 （施氮水平对不同花生品种氮代谢及相关酶活性的影响）。