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1、ieig器材与试剂干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素.纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等 具体步骤1. 水：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水2. PBS （ 也可用于其它 BSS ,如：Hanks , D-Hanks液的配制）：主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗溶解定容：将药品（NaCl 8.0g , KCl 0.2g , Na2HPO4H2O 1.56g, KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml ,摇匀即成新配制的 PBS溶液。用HCl或NaOH
2、 调PH到7.4。移入溶液瓶内待消毒：将 PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸熠水补充蒸发掉的水份。3. 胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH为8.0、温度为37 C时，胰 酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、 Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS ,如：D-Hanks 液。终
3、止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25 %,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS （D-hanks ）液中。搅拌混匀，置于 4 C内过夜。用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20 C保存以备使用。4. 0.05 %胰蛋白酶一0.02%EDTA 溶液称取胰蛋白酶粉末（1 : 250 ） 0.05g , EDTA 0.02g ，加入PBSA 100ml, 0.22um 微孔滤膜过滤除菌，分装，于20 C保存。5
4、. 青、链霉素溶液：所用纯净水（双蒸水）需要 15磅高压20分钟灭菌。 具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是 100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升 各为20万单位。分装于20 C保存。使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml o6. RPMI1640 :溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中，并用双蒸水冲洗包装袋2-3次（冲洗液一并加入培养基中）,充分搅拌至粉剂全部溶解，并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,使青链霉素的浓度最终各为10
5、0单位/ml o然后用二氧化碳或碳酸氢钠调 PH到7.2左右。最后定容至1000ml,摇匀。安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸 下支架腿分别用布包好待消毒。抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4C冰箱内待用。使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4 C时两周有效）。7. 血清的灭活：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在 56 C水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。8. HEPES 溶液：HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（
6、 M -a-hydroxythylpiperazine-M -ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为 10-50mmol/L，一般培养液内含 20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至 1L。0.22um 微孔滤膜过滤除菌，分装后4C保存。注意：因为现在市售 HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES 的终浓度仍然为 20m mol/L 。如：称取 4.766 克H
7、EPES 溶于20ml 三蒸水中， 过滤除菌后可完全（20ml ）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。9. 谷氨酰胺：合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质， 谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于 谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4C下放置1周可分解50 %，故应单独配制，置于-20 C冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4C冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1 4mmol/L 。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用
8、时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g 溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L 的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20 C保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。10. 肝素溶液的配制：含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml o因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为？ C。使用时，向100ml培养液中加入1ml （精确可加入0.9ml ） 即可。11. I型胶原酶：0.1 % I型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配
9、制和消毒灭菌。注意：因为I型胶原酶分子颗粒比胰酶大， 不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入 10ml小瓶-20 C保存。12. 明胶溶液：因为明胶难于过滤，所以配制0.1 %明胶溶液必须用无菌的 PBS配制。所以制备过程中必须要注意 无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量 0.1克（配成100ml溶液）一即解决无菌分装药品的问题。 其次要注意即使是 01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌操作分装入50ml小瓶中，4 C保存13. Hanks 液：称取 KH2PO4 0.06g, Nacl 8.0g , NaHCO3 0.35g, KCl 0.4g ,葡萄糖 1.
10、0g ,Na2HPO4.H2O 0.06g ，加 H2O 至 1000ml注：Hanks 液可以高压灭菌。分装于 4 C下保存。14. D-hanks 液：1 液：NaCL:8.00g/L , KCL: 0.04g/L, Na2HPO4.2H2O:0.06g/L, KH2PO4:0.06g/L,配500毫升；2 液：NaHCO3 : 0.35g/L ，配 100 毫升；3液：酚红：0.02g ，用数滴NaHCO3 溶解酚红将2, 3液移入1液中。定容到1000毫升PH值是7.4左右。分装于4C下保存。15. Giemsa 染液：称Giemsa 粉末0.5克，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的
11、甘油总量为33ml ）。56 C中保温90120 分钟。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为 Giemsa 原液。 使用时按要求用 PBS稀 释。一般稀释10倍。器材与试剂干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素.纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等 具体步骤1. 水：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水2. PBS （ 也可用于其它 BSS ,如：Hanks , D-Hanks 液的配制）：主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗溶解定容：将药品（NaCl 8.0g, KCl 0.2g , Na2HPO4H2O 1.56g, KH2PO4
12、0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml ,摇匀即成新配制的 PBS溶液。用HCl或NaOH 调PH到7.4。移入溶液瓶内待消毒：将 PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸熠水补充蒸发掉的水份。3. 胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH为8.0、温度为37 C时，胰 酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化
13、过度造成细胞损伤。因Ca2+、 Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS ,如：D-Hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25 %,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS （D-hanks ）液中。搅拌混匀，置于 4 C内过夜。用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20 C保存以备使用。4. 0.05 %胰蛋白酶一0.02%EDTA 溶液称取胰
14、蛋白酶粉末（1 : 250 ） 0.05g , EDTA 0.02g ，加入PBSA 100ml, 0.22um 微孔滤膜过滤除菌，分装，于20 C保存。5. 青、链霉素溶液：所用纯净水（双蒸水）需要 15磅高压20分钟灭菌。 具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是 100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升 各为20万单位。分装于20 C保存。使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml c6. RPMI1640 :溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中，并用双蒸水冲洗包装袋2-3次（冲洗液一并
15、加入培养基中）,充分搅拌至粉剂全部溶解，并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml o然后用二氧化碳或碳酸氢钠调PH到7.2左右。最后定容至1000ml,摇匀。安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸 下支架腿分别用布包好待消毒。抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4C冰箱内待用。使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4 C时两周有效）。7. 血清的灭活：细胞培养常用的是小牛
16、血清，新买来的血清要在 56 C水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。8. HEPES 溶液：HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（ M -a-hydroxythylpiperazine-M -ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为 10-50mmol/L，一般培养液内含 20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后4C保存。注意：因为现在市售 HE
17、PES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES 的终浓度仍然为 20m mol/L 。如：称取 4.766 克HEPES 溶于20ml 三蒸水中， 过滤除菌后可完全（20ml ）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。9. 谷氨酰胺：合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质， 谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于 谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4C下放置1周可分解50 %，故应单独配制，置于-20 C冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养
18、液在4C冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1 4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g 溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20 C保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。10. 肝素溶液的配制:含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml o因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于 100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温
19、度为？ C。使用时，向100ml培养液中加入1ml （精确可加入0.9ml ） 即可。11. I型胶原酶：0.1 % I型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为I型胶原酶分子颗粒比胰酶大， 不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20 C保存。12. 明胶溶液：因为明胶难于过滤，所以配制0.1 %明胶溶液必须用无菌的 PBS配制。所以制备过程中必须要注意 无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量 0.1克（配成100ml溶液）一即解决无菌分装药品的问题。 其次要注意即使是 01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌操作分装入 50ml 小瓶中，4
20、 C保存。13. Hanks 液：称取 KH2PO4 0.06g, Nacl 8.0g , NaHCO3 0.35g, KCl 0.4g ,葡萄糖 1.0g ,Na2HPO4.H2O 0.06g ，加 H2O 至 1000ml注：Hanks 液可以高压灭菌。分装于 4 C下保存。14. D-hanks 液：1 液：NaCL:8.00g/L , KCL: 0.04g/L, Na2HPO4.2H2O:0.06g/L, KH2PO4:0.06g/L,配500毫升；2 液：NaHCO3 : 0.35g/L ，配 100 毫升；3液：酚红：0.02g ，用数滴NaHCO3 溶解酚红将2, 3液移入1液中。定容到1000毫升PH值是7.4左右。分装于4C下保存。15. Giemsa 染液：称Giemsa 粉末0.5克，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml ）。56 C中保温90120 分钟。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为 Giemsa 原液。 使用时按要求用 PBS稀 释。一般稀释10倍。