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1、实验十 用梯度平板法筛选大肠杆菌抗药性突变株【实验目的】 ：了解并熟悉抗药性突变株的筛选原理和方法【实验原理】 ：经诱变处理后的微生物群体中，虽然突变的数目大大增加，但所占的比例仍 然是整个群体中的极少数。 为了快速、 准确地得到所需的突变体， 必须设计一个合理的筛选 方法，以杀死大量的未发生突变的野生型，而保留极少数的突变型。梯度平板法是筛选抗药性突变型的一种有效简便方法， 其操作要点是： 先加入不含药物 的培养基， 立即吧培养皿斜放， 待培养基凝固后形成一个斜面， 再将培养皿平放， 倒入含一 定浓度药物的培养基， 这样就形成一个药物浓度梯度由浓到稀的梯度培养基， 然后再将大量 的菌液涂布于
2、平板表明上。经培养后，在高浓度药物处出现的菌落就是抗药性突变型菌株。 【材料和器皿】 ：（1） 菌种：大肠埃希氏菌（2）培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，2X（ 2倍浓度）牛肉膏蛋白胨培养液（分装于小三角瓶中，每瓶装 20ml ），生理盐水。（ 3） 器皿：培养皿，涂布棒，移液管，滴管，离心机 【方法和步骤】 ：1 制备菌液从已活化的斜面菌种上挑一环大肠埃希氏菌于装有 5ml 牛肉膏蛋白胨培养液的无菌离心 管中（接2支离心管），置37C条件下培养16h左右，离心（3500r/min , 10min），弃去上 清液后再生理盐水洗涤 2 次，弃去上清液，重新悬浮于 5ml 的生理盐水中。并且将 2支
3、离 心管的菌液一并倒入装有玻璃珠的三角瓶中，充分振动以分散细胞，制成108/ml 的菌液。然后吸 3ml 菌液于装有磁力搅拌棒的培养皿中。2 紫外线照射（1） 预热紫外灯：紫外灯功率为15W照射距离30cm。照射前先开灯预热 30min。（2） 照射：将培养皿放在磁力搅拌器上，先照射1min后再打开皿盖并计时， 当照射达2Min 后，立即盖上皿盖，关闭紫外灯。3 增殖培养（ 在暗室红灯下操作）照射完毕，用无菌滴管将全部菌液吸到含有3ml 2 X牛肉膏蛋白胨培养液的小三角瓶中，混匀后用黑纸包裹严密，置 37 C培养过夜。4 制备梯度培养皿取10ml牛肉膏蛋白胨琼脂培养基于直径9cm的培养皿中，立
4、即将培养皿斜放，使高处的培养基正好位于皿边与皿底的交接处。待凝固后，将培养皿平放，在加入含有链霉素（100卩g/ml ）的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基10ml。待凝固后，便得到链霉素从到0逐渐递减的浓度梯度培养皿。然后在皿底做一个“f”符号标记。5 涂布菌液将增殖后的菌液进行离心（3500r/min , 10min）,弃去上清液，再加入少量生理盐水（约0.2ml ）,制成浓的菌液后将全部菌液涂布于梯度培养皿上，并将它倒置于37C恒温箱中培养24h，然后将出现于高药物浓度区内的单菌落分别接种到斜面上，经培养后再做抗药性测 定。6 抗药性测定（1）制备含药平板：取链霉素溶液（750卩g/ml ） 0.2
5、、0.4、0.6、0.8ml，分别加到无菌培 养皿中，再加入融化并冷却到 50C左右的牛肉膏蛋白胨培养基 15ml，立即混匀，平置凝固 后即成一个对照平板（不含药物） 。8 等分，并注明 18 号，然后将（2）抗药性的测定：将上述每个皿底的外面用记号笔画成若干抗药菌株逐个划在上述 4种浓度的药物平板上和对照平板上。每一皿必须留一格接种出发菌株。然后将所有的培养皿倒置于37C恒温箱中培养过夜。第二天观察各菌株的生长情况，并记录结果。【结果记录】将各菌株抗药性测定结果记录于下表中。菌株号含药平板/ （卩g.ml ）对照平板不含药物10203040012345678（出发菌株）注：以"+”表示生长，“-”表示不生长。结果：你选到抗药菌株 株，最高抗药性达 卩g/ml。【注意事项】：1制备含药平板时，务必使药物与培养基充分混匀。2严格无菌操作，勿将含药平板上的杂菌误认为是抗药性大肠埃希氏菌。【思考题】：1未经诱变的菌株在含药平板上是否有菌落出现？为什么？2你选出的抗药性菌株中， 如有一支抗链霉素的菌株在含药平板上能生长，在不含药平板上反而不生长，这说明什么？