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1、候选microRNA反义链干预肝纤维化形成应用研究可行性报告一.立项的背景和意义肝纤维化（Hepatic fibrosis）是多种慢性肝病病情发展的共同病理基础，是临床向肝硬化发展的必经中间环节。近年来人们对其发生机制进行了广泛探 讨，认为早期肝纤维化经有效治疗，仍有逆转可能，我国是肝炎大国，有大量的 乙肝病毒（Hepatitis B virus, HBV及丙肝病毒（Hepatitis C virus , HCV感染者，其中1020%勺乙肝病毒感染者和高达50%勺丙肝病毒感染者将发展为慢性 肝炎、甚至肝硬化，积极开展肝纤维化治疗方面的研究显得尤为迫切。本课题组在已经采用RNAF扰沉默TGF0
2、/smads相关基因明显减轻肝胶原合 成的基础上，通过miRN慰片技术、生物信息学和分子生物学技术发现的确有些 高表达和低表达miRNAT能调控TGF-B 1/SmadsW号通路相关基因，初步证实了我 们以前的猜测。本项目将进一步研究这些候选的miRNA差异表达变化可能是肝纤 维化形成中起桥梁作用，通过寻找“转录因子-miRNA'交互作用的分子网络，期 望初步阐明肝纤维化中TGF-B 1信号的分子网络调控机制。同时，继成功应用TGF B R2-siRNA抑制肝纤维化胶原合成后，考虑到miRNAW空基因表达是通过机体的 内源性调控通路，具有更高的稳定性和组织相容性， 更低的毒副作用，我们
3、将利 用筛选的miRNA勺反义链和miRNA1核表达质粒在细胞和动物水平调节肝纤维化 中miRNN氐和过表达，进行干预肝纤维化实验，试图为今后 miRNA台疗肝纤维化 提供新靶点和实验数据，具有较高科学意义。二.国内外研究现状和发展趋势目前肝纤维化药物治疗主要针对的靶点有去除病因、消除炎症、抑制肝 星状细胞激活、抑制肝星状细胞分泌胶原、促进肝星状细胞的凋亡及促进胶原 的降解等方面。如：干扰素、秋水仙碱、已酮可可碱、汉防已碱等，但是毒副 作用多，限制了临床的应用。近年来，基因阻断技术在机理和功能研究中有很 大进展，如：核酶和RNAF扰等，但同样因毒副作用大限制了发展。因此，寻 找高效稳定和低毒副
4、作用的抗肝纤维化治疗手段，仍是肝纤维化研究面临的重大课题。hepatic不仅是肝纤目前研究认为肝脏复杂的炎症细胞因子网络和肝星状细胞（ stellate cells , HSCs的激活在肝纤维化过程中起关键作用,维化的最终共同途径，而且是肝纤维化发生的中心环节。 激活的星状细胞可以 转化为肌成纤维母细胞，分泌大量的细胞外基质(Extracellular matrix ,ECM) 导致肝脏ECM勺合成与降解的失衡，ECMfc肝脏的过度沉积导致肝脏结构的改 变进而转变为肝纤维化甚至肝硬化。星状细胞的激活活化、增殖和分泌细胞外 基质涉及到复杂的炎症免疫网络，许多信号通路都在肝纤维化形成中起到一定 的
5、作用，其中TGF0 /Smads信号转导通路在星状细胞的激活和肝纤维化形成过 程中起关键作用。因此，通过干预 TGF0 /Smads(transforming growth factor beta , TGF0 )信号转导通路进而干扰星状细胞的活化、增殖和分泌ECM勺能力有望能达到治疗肝纤维化的目的。近年研究表明，小分子RNA(microRNA, miRNA可能在miRNA转录后基因沉 默中发挥着重要作用。miRNA是存在于各种生物体内的由19-22个核糖核甘酸组 成的一类新型小分子RNA miRNA来自于内源性基因组DNA的非编码区的直接转 录，首先在核内生成miRNA前体(pre-miRN
6、A),继而在转运体的运载下由细胞 核移出至胞浆，经Dicer酶切割成熟并与Argonaute ( AGO蛋白组装成RNA诱 导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC),并与靶 mRNA®过尚 不明确的碱基配对方式互补结合，从而切割降解目的mRNAE仅抑制靶mRNA勺进 一步翻译，产生相应的功能表型缺失，其究竟执行何种功能取决于AGO蛋白亚类 是否具有内切核酸酶活性及miRNA与miRNA勺互补配对程度，这一现象属于转录 后基因沉默(post-trans criptional gene silencing, PTGS ),基本类似于干 扰性小
7、RNA( small interferingRNA, siRNA),但两者亦有着本质区别。siRNA的发夹状dsRNA前体多源于病毒感染、外源基因的导入或转座子，因而其主要发 挥抗病毒和维持基因组稳定的作用；miRNA则来自内源基因(定位于着丝点附近) 的直接转录。按照人类基因组非蛋白编码区中1-5 %编码miRNA的保守估计，则细胞中应约有1000余种miRNA而每一种miRNA又可按照完全或不完全配对方式 调控约200种靶mRNA译，则细胞中应有超过1/3的蛋白编码基因接受miRN即控(其他转录后调节机制尚包括翻译后蛋白亚基的组配和磷酸化修饰等)。 miRNA 可通过此种互补序列的结合反作
8、用于其靶 mRN A从而关闭或调节相关基因的表 达，甚至可通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。鉴于miRNAT调控蛋白编码基因表达的功能，使我们利用生物信息学手段设计特定靶标人工miRNA!于肝纤维化的治疗成为可能。2009年Roderburg C等研究发现，在鼠和人肝纤维化肝脏 miR-29的下调与 肝纤维化发生明显相关，部分 miRNA昆E肝纤维化肝脏和正常对照肝脏组织中存 在显著差异表达，可能参与了调控肝纤维化发生。这一发现给利用miRNA台疗肝 纤维化带来了曙光，但 miRNA的表达降低如何导致肝纤维化发生的机制尚需要 进一步深入研究。近来，miRNA甜$ TGF0 / smads
9、信号通路参与许多重大疾病 发生发展得以广泛重视，WangB等发现miR-181调控TGF0信号通路参与肝癌发 生，Leeper NJ等发现miR-26调控TG用信号通路促进血管瘤形成。但 miRNA 如何调控TGF0 /smads信号通路参与肝纤维化发生，国内外仍是空白。综上所述，说明某些关键性miRNAfe衡表达确实是肝纤维化始发和演进的重 要分子事件，但miRN原竟通过何种机制调控肝纤维化的发生发展尚未明确，以 及那些miRNAT以作为今后治疗肝纤维化的靶点目前不清楚。主要参考文献：1、Heathcote EJ.Treatment of hepatitis B: the next five
10、 years. Clin Med. 2007 Oct; 7(5):472-7.2、Davis-Dusenbery BN, Hata A.Smad-mediated miRNAprocessing: A critical role for a conserved RNA sequence. RNA Biol. 2011 Jan 1;8(1).3、 Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 2009 Jan 23;136(2):215-33.4、Winter J, Jung S, Keller
11、S,et al. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol. 2009 Mar;11(3):228-34.5、日me n J, Lindow M, Schu tz S,LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 2008 Apr 17;452:896-9.6、Davis BN, Hilyard AC,et al. SMAD proteins control DROSHA-medi
12、ated microRNA maturation. Nature. 2008 Jul 3;454:56-61.7、Roderburg C, Urban GWBettermann K, et al. Micro-RNA profiling revealsa role for miR-29 in humanand murine liver fibrosis. Hepatology. 2011Jan; 53 (1):209-18.8、Wang B, Hsu SH, Majumder S .TGFbeta-mediated upregulation of hepatic miR-181b promot
13、es hepatocarcinogenesis by targeting TIMP3. Oncogene. 2010 Mar 25; 29 (12):1787-979、Inui M, Martello G, Piccolo S.MicroRNA control of signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010 Apr;11(4):252-63.10、Leeper NJ, Raiesdana A, Kojima Y,et al.MicroRNA-26a is a novel regulator of vascular smooth muscl
14、e cell function. J Cell Physiol. 2011 Apr;226(4): 1035 -43.三.研究开发内容和技术关键 1、研究内容：(1)采用美国Signosis公司大鼠miRNA5片分析肝纤维化组织与正常肝组织 miRNA!异表达谱，并以Northern-blotting和实时定量RT-PC迸行验证。(2)利用生物信息学技术预测候选靶向调控 TGF-B 1/SmadsB号通路 相关基因的miRNA(3)采用SBI公司的pCDHS病毒表达载体构建候选miRNAC核表达载 体，以及人工合成候选miRN版义寡核甘酸。(4)采用美国Signosis公司的miRNAt光素酶
15、报告载体加以验证候选 miRNAW靶 基因3' UTR勺靶位点结合，并进行突变实验，以实时定量 RT-PCR口 Western-blotting分析其相对应的靶mRNA目的蛋白表达状况，选取与靶位点结合的miRNA(5)将筛选的miRNAC核表达载体和人工合成miRN版义寡核甘酸在 脂质体。辅助下分别转染HSC-T6a胞，使得相应的靶miRNAS表达或 者低表达，观察对HSC-T6g胞生物学特性的影响。(6)将筛选的miRNAC核表达载体和人工合成miRN版义寡核甘酸尾 静脉注入大鼠肝纤维化模型，研究筛选 miRNAF预肝纤维化作用。 2、技术关键：(1) miRNAfe达载体和反义m
16、iRNAJ行体内外实验最佳条件的摸索与优化；(2)初步阐明miRNAF控TGF0 /Smads1号分子网络机制。四.预期目标（主要技术经济指标、知识产权申请情况、应用前景）1、主要技术指标1）筛选鉴定出靶向调控TGF0 /Smad此号基因的miRNA分子。2）初步得出miRNAWTGF0 /SmadsW号间调控肝纤维化的分子网络机制。3）候选miRNAT用于抗肝纤维化，为抗肝纤维化新型基因药物提供新靶点。4）在国内省级学术杂志以上发表论文 1篇。2、知识产权申请情况本研究结果将用于社会公益事业，不拟申请知识产权。3、应用前景本研究完成将为今后miRNAB疗肝纤维化提供新靶点和实验数据。该项研究
17、具有 较明显的科学价值和社会意义。五.研究方案、技术路线、组织方式、课题分解1、研究方案1）大鼠肝纤维化组织miRNA1因芯片分析。大鼠肝纤维化造模，应用美国Signosis公司大鼠miRNAE片，取正常肝组织和不 同时间段肝纤维化组织，提取总RN做miRNAS因芯片寻找二者显著差异miRNA 通过Northern-Blotting 方法检测各个miRNA分子表达水平，Real-time RT-PCR 技术比较肝纤维化组与正常对照组靶基因 mRNA平差异，检测结果与miRNA!因 芯片结果进行比较。2）差异miRNA!TGF0 /smads信号通路基因的相关性预测。2）通过生物信息学技术，应用
18、互联网上 3个最常用的miRNAE基因预测数据库 （Pictar、Targetscan、MiRbase）在线服务站点搜索预测差异 miRNA勺靶基因，确 定TGF0 /smads信号通路相关基因那些可能是差异miRNA勺靶基因。3） miRN版义寡核甘酸和真核表达质粒构建。根据 MiRBase（http:/www.sanger.ac.uk/software/Rfam/mirna） 提供的 miRNA 基因序列，获取大鼠miRNA勺序列，设计相应的反义寡核甘酸序列并采用 BLAST 软件进行分析，并确定一条随机对照序列，PAG物化，全硫代修饰，以上序列将 由上海吉玛制药技术有限公司合成。同时将各
19、个 miRNA前体（pre-miRNA）克隆 到载体pCDH-CMVMCS-EF1-copGFP建慢病毒表达载体，同时设计构建阴性对照 miRNAS病毒表达载体。4）双荧光素酶报告载体用于验证miRN活口靶基因之间作用。把相应miRN版义寡核甘酸或真核表达质粒、含靶位点的荧光素酶报告基因载体 （具有miRNA勺靶基因的3'UTR）及对照载体共同转染 HSGT6细胞，获得稳定 表达荧光素酶的细胞株，检测荧光素酶强度，比较处理组与对照组的荧光素酶活 性，根据荧光强度值的变化来确定二者是否有调控关系，初筛miRNA勺靶基因，进一步采用含突变靶位点的荧光素酶报告基因载体做突变实验，验证初筛结果
20、， 筛选出靶基因的miRNA子。5）观察筛选的miRNAi表达和低表达在细胞水平对肝纤维化干预作用。细胞培养，分别利用LipofectamineTM 2000将反义miRN片口真核表达载体转染 HSC-T8田月fi, Real-time RT-PCR技术比较转染组与对照组靶基因 mRNAK平差 异，Western Blotting方法分析蛋白水平差异，进一步采用 real time RT-PCR测 a-SMA I、III 胶原的 mRNA1达,Western-blot 测 a-SMA I 和III 胶原的蛋 白表达以及MTTS验。6）观察筛选的miRNAS表达和低表达对大鼠肝纤维化干预作用。大
21、鼠肝纤维化造模，从大鼠尾静脉分别注射反义 miRNARmiRNAt核表达质粒， Real - time RT-PCR技术比较干预组与对照组靶基因 mRNAK平差异，Western- Blotting 方法分析蛋白水平差异，进一步采用 real time RT-PCR 测a-SMA I 和III胶原的mRNA达，Western -blot测a-SMA I、III胶原的蛋白表达，masson 胶原染色肝纤维化的胶原。2、技术路线大鼠肝纤维乎模型造模总RNA叶蛋白提取Z大鼠miRNA芯片检测差异表达 miRNANorthern-blotting和 QRT-PC验证差异的 miRNA生物信息学预测候选
22、 miRN府口靶基因荧光素酶报告载体验证 miRN所口靶基因之间作用3、组织方式课题组成员分别承担 大鼠肝纤维化模型造模、总RNA和蛋白提取、大鼠miRNA 芯片检测差异表达miRNA Northern-blotting 和QRT-PC险证差异的miRNA 生物信息学预测候选miRN用口靶基因、荧光素酶报告载体验证miRNAffi靶基因之 间作用、合成反义 miRN用口构建慢病毒真核表达载体、转染 HSC-T6细胞和体外 干预肝纤维化、尾静脉注入大鼠，体内干预肝纤维化等。4、课题分解本研究可分为 Northern-blotting 和QRT-PC配证差异的 miRNA转染HSC-T6 细胞，体
23、外干预肝纤维化、尾静脉注入大鼠，体内干预肝纤维化等几个子课题。六.计划进度安排2012.01 2012.06:细胞培养、设计合成miRN版义寡核甘酸和构建真核表达质 粒,采用美国Signosis公司的miRN能光素酶报告载体加以 验证候选miRNA2012.07-2012.12:转染HSC-T6ffl胞，检测靶基因和蛋白表达、 胶原检测和细胞 毒性实验。2013.01 2013.10:肝纤维化造模、干预肝纤维化动物实验，检测肝纤维化相关 指标。2013.102013.12:补充部分实验，数据分析和总结，撰写相关研究论文、结题 报告。七.现有工作基础和条件我科为浙江省龙头学科，科研水平较高。我院
24、中心实验室，具备开展本项目实验 工作的全部设备条件。我们直接可利用的仪器设备有： 低温超速离心机、恒温恒 压电泳仪、PE9600 PCR扩增仪、分光光度计、超净工作台、 C02培养箱、凝胶 图像分析系统、荧光显微镜、Lightcycler 荧光定量PCR仪、Northern- blotting相关设备和-70 C冰箱等。项目负责人为医学博士，硕士生导师，感染病科副主任医师，从事肝纤维化研究十余年，主要研究领域为肝纤维化发生机制研究。主持和参与国家、省部级肝纤维化课题多项，2008年，中请浙江省自然科学基金项目获得全额资助（编号：Y2080599 ,多篇肝纤维化研究论文在国内外发表。已完成了温州
25、科技局立项资助课题项目：TGF0 RII短发夹RNA抗肝纤维化的研究。项目编号：Y20070045，发表论文TGF0 RII Expres- sionInhibits the Activation of Hepatic Stellate Cells and Reduces collagen synthesis » . Experimental Biology and Medicine , 2011, IF=2.95。申请者 已熟练掌握本项目中所需要的实验技术和实验方法。八.经费预算项目经费（万元）项目总 经费自筹 部分银行贷款部 分|可巾科 技局 申请部 分5.05.000经费开支预 算（万元）设备费能源材料费设计实验费信息费会议 调研 费0.33.00.20.20.3租赁费验收费人员费其他费用/0.20.60.2/