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1、现代生物学技术在微生物检验中的运用摘要：微生物检验技术正从传统的培养办法向现代生物学方向发展，这是微生物检验技术发展的趋势。本文向大家介绍了近年来一些现代生物学技术在微生物检验中的运用。关键词：微生物检验；生物学技术近年来，随着现代分子生物学技术的飞速发展，快速、准确、特异检验微生物的新技术、新办法不断涌现，微生物检验技术向仪器化、自动化、规范化方向发展，提高了微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。本文将近几年来现代生物学技术在微生物检验中的运用进行了详细介绍。1荧光显微计数的快速微生物检验技术从传统微生物检验技术的根底上发展而来的快速微生物检验办法已经将近30年，在微生物检验技术上并没有本
2、质上的提高，只是在微生物的样品准备上和微生物的计数上相对于传统微生物检验办法有所提高。这些年,一种新的快速微生物检验办法得到了更为广泛的应用，这种办法可以实现微生物检验的实时监控。这种微生物检验办法是通过膜过滤法对可过滤样品首先进行过滤，在过滤后，将样品经过适当的温度和适当的时间进行培养，再使用比拟先进的微生物检测技术对微孔过滤膜上的微生物进行检测，由于检测伎俩比拟先进，因此在微生物经过一段非常短的时问后，就可以使用先进的激光扫描装置或者高倍的CCD显微镜对微菌落进行检测，这种快速微生物检验办法的培养时间通常是非常短的，这种办法已经被全球的大型食品饮料企业所采用，并证明是十分有效的。比方MIL
3、LIPORE公司的快速微生物检验系统就是基于以上原理而形成的快速微生物检验装置，它是首先将样品过滤，将微生物富集在带有网格的微孔过滤膜上，经过短暂的培养后，通过高倍微生物成像技术将微生物检验结果以CFU的形式输出在电脑中并通过打印机打印出来。2聚合酶链反馈技术聚合酶链反馈，又称PCR技术，是近几年发展起来的一种快速的特定DNA片段的体外扩增法，一般与电泳连用。PCR技术可以用来对发酵中的某些特定菌进行检验和鉴定，与传统办法相比，它的最大特点是快速、准确。其原理为通过加热使双链DNA经裂解成两条单链，成为引物和DNA聚合酶的模板；然后减低温度，使寡聚核苷酸引物与DNA分子上的互补序列退火。通常退
4、火温度越高，PCR扩增特异性越好。下一步把温度升高，使DNA合成得以进行，合成的DNA片断越大，所需时间越长。如此重复上述加热变性双链、引物退火和链延伸循环过程，每次循环将靶DNA扩增一倍。经3-4h后，就能使靶DNA扩增许多倍。测定PCR产物的办法较多，如凝胶电泳法、比色测定法以及化学发光测定法等。目前，已有自动4EPCR检测试剂盒对仪器，使用方便，如美国杜邦快立康公司的BAX。病原菌检测系统，可检测沙门氏菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌等。虽需增菌且需专用设备,但PCR技术是一项全新的技术，快速、灵敏、准确，在细菌诊断方面具有广大的前景。3生物芯片技术生物芯片技术是20世纪后期发展起来的
5、新技术，在生命科学的各个领域逐渐得到广泛应用。值得注意的是,该技术在微生物学领域，特别是在病原微生物检验、病原微生物的基因组和基因变异性及基因多态性分析、病原微生物的致病机制、病原微生物感染后宿主机体基因叙述的变化有很好的应用性。利用生物芯片技术可以研究病原微生物基因组及其在不同环境下的变异性和多态性。已有人用高密度艾滋病cDNA芯片对人类免疫缺陷病毒(HIV)反转录酶和蛋白酶基因的多态性进行了研究。Bjorkholml分析了幽门螺杆菌两亚群在宿主体内基因叙述的差别，该差别决定其向稳定的基因型和表型分化。Schembirl利用DNA点阵技术研究了大肠埃希菌(简称大肠杆菌)1型菌毛基因叙述的差别
6、引起大肠杆菌定植能力的改变，清除全部菌毛基因的叙述会触发另一个外表蛋白抗原A39的叙述，独自清除菌毛H基因的叙述不影响其他菌毛基因和外表蛋白抗原A39的叙述，但显著降低其他菌毛基因的叙述量。利用寡核苷酸点阵技术也可分析微生物基因组在转录调节基因作用下的基因叙述状况。生物芯片技术的发展也促进了一门新兴学科-生物信息学的发展。生物芯片所得到的复杂信息需要生物信息学技术加以分析整理才能得到所需的信息。通过网络将所研究的结果与世界上其他地方的数据库及研究结果进行比照分析，可了解疾病，尤其是传染病的流行态势。4生物荧光技术近年经常使用的生物荧光检测技术是基于荧火虫发光机理所设计，荧火虫发光细胞内具有特殊
7、的发光物质-荧光素及荧光素酶，荧光素易被氧化，它在荧光素酶催化下，由ATP激活，使之与氧结合，荧光素分子中的电子跃迁到高能级，处于不稳定的激发态，当电子跳回到低能级时，即发出荧光光子。由于ATP能不断提供能量，因而荧光素分子不断地被激活，即可连续地发出荧光，其荧光强度与ATP浓度在一定范围内成线性关系，通过用发光光度计，可以检测出待测液中ATP含量。ATP是一种高能磷酸化合物，起着生物系统能量交换的中心作用，所有活细胞都含有ATP分子，不论其生长过程和培养条件如何，它的含量大致是一定的。通过荧光检测，可以很快测出样品中的微生物总量。Waes等描述了用生物荧光办法来检测30贮存产品中细菌的生长情
8、况。他们在实验中取UHT奶样品，在30预培养ld，用ATP双磷酸酶(0.1u)处理除去产品中的游离ATP，用荧光素一荧光素酶办法进行检测，这种办法对UHT巧克力奶特别有用。另外，生物荧光检测也常被用来检测奶粉中的细菌总数。Phillips和Griffiths在巴氏杀菌奶中添加结晶紫(20mg/L)，青毒素200mg/L)和Nisin(40mg/L)，经2l，25h的选择性培养，G-适冷菌生长良好，而G+|的生长受到抑制。用ATP生物荧光法测得选择性培养牛奶中的ATP量后，就可预测巴氏杀菌奶的货架期，并且这种试验和最近欧洲委员会介绍的保证质量试验的结果是一致的。5其他办法酶联免疫吸附法(ILIS
9、A是用于定性或定量测定特异抗原体的一种技术，它多采用"夹心式"设计，即用抗体包被的聚苯乙烯孔捕获抗原，用另一个结合了酶的抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物，再用一种生色酶底物通过肉眼察看或比色法记录结果。随着单克隆抗体酶联免疫技术的出现，免疫检测法的特异性有了明显的提高。美国肉食动物研究中心最近采用两个与Ecoli0157H7鞭毛蛋白发生特异反馈的单抗隆抗体2B7和46E9-9对E.coli0157进行特异性检测。微型全自动荧光酶标分析仪主要应用酶联荧光技术(ELFA)，ELFA技术具有优异的敏感性和特异性，抗原的检测是应用一种夹心GELFA技术，SPR包被针上拥有抗体包被，
10、所测的荧光与抗体中抗原的含量成正比，内设自检系统，可检验李斯特氏菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、葡萄球菌肠毒素、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌O157。使用该仪器操作简便，只须加一次样品，按一次键，整个检测过程都由仪器自动完成。多数试验50分钟内结束(不含增菌过程)，无交叉污染。随着生物技术的发展，检验微生物的办法还将继续推出，继续缩短检验时间，提高检验效率，使检验结果的灵敏度和特异性也有了保证。今后微生物检验技术的发展方向是提高检验效率，即方便、快速和大批量与检验的高精度和高灵敏度。参考文献：【1】YSHe，AmericanSocietyforMicrobiology，62(9)3325，2008【2】林万明，临床基因探针诊断实验技术，上海科学技术出版社，3，2008【3】RuurdT，Aarsmaneta1AppliedandEnvironmentalMicrobiology，59(8)2713，1993【4】BjorkholmB，LundinA，SillenA，eta1InfectImmun，200l；69(12)：7832-7838【5】SchembfiMA，UsseryDW，WorkmanC，eta1MolGenetGenomics，2008；267(6)：721-729