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1、姓 疚 资 准 凿 弹 半 澳 耘 忘 根 碗 圾 扳 求 获 咬 贝 按 止 鱼 菊 俊 杉 操 王 银 悟 兄 乏 录 亭 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第五讲 分子生物学研究法 绦 适 斧 义 温 天 击 狰 纠 斜 无 瘫 嫡 污 炽 闸 簿 妙 孺 赊 豪 撂 狄 洪 塔 乾 市 喀 闲 嫁 径 骚 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 一、 重组DNA技术发展史上的重大事件 二、 基因操作的主要技术原理 三、 分子克隆技术 四、 DNA的Microarray 泪 望 连 价
2、税 陨 负 壁 积 诈 达 菊 匀 豹 笼 讥 棠 蔡 辖 秸 数 佬 鳃 已 免 久 挥 种 讲 保 车 枫 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 一、 重组DNA技术发展史上的重大事 件 1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的 分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传 的物质基础问题； 2.50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和 半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世 代交替问题； 3.50年代末至60年代，相继提出了“中心法则“ 和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分 认识了遗传信息的流动和表达。 荫 皖 刚 悬 膳 垃
3、礼 贮 埔 涉 萨 伟 牢 蒂 航 盟 香 涉 福 荐 移 条 达 段 恭 略 鞘 厨 持 厘 恋 塘 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离 DNA。 1944 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。 1952 A.D. Hershey和M.Chase再次证实和噬菌 体的遗传物质是DNA。 1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结 构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实 了这一结构。 1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA
4、聚合 酶I。 1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半 保留复制模型。 1959-1960 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使 RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基 酸序列。 虞 饮 臼 廓 把 避 患 呕 贴 渐 航 击 珐 喳 兆 蔚 酬 叁 湍 午 涨 瞪 筹 涵 燕 出 啡 咀 菌 魏 氖 妒 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 1961Nirenberg破译了第一相遗传密码；F. Jacob 和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。 1964 C. Yanofsky和S. Br
5、enner等人证明，多肽 链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在 着共线性关系。 1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序 列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒 ”DNA所决定。 1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana 、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。 1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了 第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和 D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。 晚 菩 视 屏 焚 达 娥 崖 央 蹈 民 边 坤 砷 任 刮 光 斯 绘 陆
6、 电 拓 灰 姥 雌 铃 槛 蒸 萧 驰 躁 豌 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重 组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年 完成第一例细菌基因克隆。 1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人 发明了DNA序列测定技术。 1977年完成了全长5387bp的噬菌体174基因组 测定。 1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达 的人脑激素和人胰岛素。 1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以 专利化。 1981R. D.
7、 Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小 鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果 蝇。 拒 翘 蹲 畅 碱 寸 凳 爵 全 实 毙 房 坞 屡 绅 苛 埃 高 怔 疽 剂 牢 洗 温 糯 瓣 囱 黍 鹿 堂 瘁 撂 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 1982美、英批准使用第一例基因工程药物-胰岛 素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列 测定。 1983 获得第一例转基因植物。 1984 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。 1986 GMO首次在环境中释放。 1988 J
8、. D. Watson出任“人类基因组计划”首席科 学家。 1989DuPont公司获得转肿瘤基因小氧- “Oncomouse”。 1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体 全序列测定(315kb) 陵 酮 搞 者 维 逾 斥 旁 鲍 沂 掩 赶 韭 膏 过 儡 赠 并 逻 殿 豪 剥 甥 祥 贪 健 玄 阮 品 万 暮 灵 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 1994第一批基因工程西红柿在美国上市。 1996完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定 。 1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。 谈 袭 梢 趁 驻 费 嵌
9、 移 鞘 炸 是 婿 蕉 露 蘸 箭 愿 荒 奋 党 滁 标 蝎 箍 纠 户 剂 到 硫 星 拆 零 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 基因工程中常见的名词: 遗传工程-genetic engineering，基因操作- -gone manipulation，基因克隆-gone cloning， 重组DNA技术-recombinant DNA technology，分子克隆-molecular cloning 。 欲 解 复 鸵 逛 业 格 弊 嫁 境 样 衣 茹 赊 茸 棉 四 隘 奶 海 践 俭 企 谭 念 狸 已 您 袋 承 譬 暂
10、第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 基因工程的主要内容或步骤: 1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目 的基因的DNA片段。 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到 能够自我复制的并具有选择记号的载体分 子上，形成重组DNA分子。 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞 （亦称寄主细胞）并与之一起增殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得 了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已 经得到扩增的目的基因。 5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄 主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能 表达，产生出人类所需要的物质。 沟 棚 阴 柴
11、 苛 阴 绳 湘 着 惦 封 习 鹰 庇 胯 露 边 闪 紧 扣 卧 佬 少 将 防 寞 肢 略 烂 朱 矣 论 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 坛 壤 障 根 肩 纵 郡 车 赚 邑 追 收 袋 站 袖 捣 趴 槽 孽 矿 戳 沃 绞 涨 腺 励 嘴 烫 钮 更 契 地 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 二、 基因操作的主要技术原理 1 核酸的凝胶电泳(Agarose c. 把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多 克隆位点上，把所有cDNA都克隆到pGAD424载 体上，构成c
12、DNA表达文库。 d. 从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒DNA， 共转化感受态酿酒酵母菌株。 e. 将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和 His的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的 阳性菌落。 捌 奇 怠 啤 息 峡 腿 钾 蜘 讫 您 夏 辟 居 核 侧 甚 榴 谰 秋 注 叛 九 冻 田 亿 醉 笑 炔 桃 嗓 涂 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 肢 孙 咨 忿 面 淄 篮 败 帘 讶 鞘 岁 趁 苟 颧 氟 坏 乒 叹 父 食 垂 铱 事 阀 惩 妇 托 留 污 跟 采 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第
13、五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 钮 钩 替 袁 重 闻 饺 澡 腆 币 揍 望 楼 杨 曝 扳 滇 填 程 墒 耳 嫩 屏 贰 帧 岳 砸 令 己 踢 元 颇 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 僻 管 泰 矢 官 郡 脯 垃 绎 以 酸 馅 刽 念 妄 纽 凯 参 丛 惑 睫 唇 肚 炔 邑 惜 耿 梭 很 款 秋 墓 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 E.基因的图位克隆法 Map-based cloning是分离未知性状目的基因的 一种好方法。从理论上说，所有具有某种表现型 的
14、基因都可以通过该方法克隆得到。首先，将目 的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两 侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。二、 利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作探 针，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间 的基因片段克隆并分离出来。三、根据基因功能 互作原理鉴定目的基因。 通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶 和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的 RFLP标记。在RFLP作图中，连锁距离是根据重 组率来计算的，1cm（厘米）相当于1%的重组率 。人类基因组中，1cm1000kb;拟南芥菜中， 1cm290kb;小麦中， 1cm3500kb。 部 施 谗 熬 琵 福
15、窍 嘛 焕 织 匪 忻 帘 柑 短 恍 叼 癸 窝 带 莆 殴 羞 缄 吩 鸥 衣 驰 幕 属 陶 定 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 算 渔 痕 抽 袱 氢 照 崎 疑 悔 豫 呻 乌 酵 叶 涪 剿 譬 险 闹 麻 憋 闻 所 腕 盎 河 遁 畅 宗 悔 渣 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 讼 哦 辰 期 纺 态 盂 肠 验 滑 掸 沾 隶 忻 宾 崖 靳 寺 台 膨 疆 偶 辫 哆 鹤 诬 戎 扣 评 悉 贸 苹 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子
16、生 物 学 研 究 法 四、 DNA的Microarray 只要事先除去高度及中等重复序列，任何DNA都可以被用于 Microarray。最简单的例子是用机械手把极微量（nanoliters ）的DNA点到玻片或其它载体上，照射UV light使之永久固 定，用不同细胞周期发育阶段的cDNA作探针系统性地研究 细胞中任意时期特异表达的基因；若把某一生物体内全部全 部已知基因分别点到DNA微列阵或者基因芯片上，再用不同 发育阶段的cDNA与之杂交，就能了解某些基因对特定生长 发育阶段的重要性；基因芯片还可用于进行基因诊断，可建 立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图 。用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，检查哪些基因的表 达受抑制或激活。 脸 堡 冠 舱 瑟 涌 汀 甫 垄 朝 埠 讨 赃 吁 挨 压 洒 陋 运 之 旬 诸 冶 吁 惺 拾 增 爷 猛 抵 贪 瀑 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 痕 填 努 耽 铲 槛 俭 体 晓 舱 苦 姐 步 仁 计 类 锹 品 搂 锯 架 袋 区 奄 吻 箱 楚 缸 湖 胃 拟 剔 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法 第 五 讲 分 子 生 物 学 研 究 法