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1、实验一细菌形态检查【目的】掌握示教显微镜下所看到的细菌形态和特殊结构。掌握细菌涂片制作，革兰染色操作。掌握油镜的使用和保护方法，以便娴熟应用油镜观察细菌形态或结构。一、显微镜油镜的使用和保护法（一 ）显微镜油镜的识别（1） 油镜头上都有标记：标有100X或90X ； 有白、黑或红色圆圈；（3）有油”或HI、oil字。 油镜头比其它接物镜长，孔径最小。（二 ）显微镜油镜的使用使用显微镜油镜时，勿使镜台倾斜，以免镜油流出。在玻片标本上加香柏油（ 镜油 ）一滴， 置载物台上，使有标本处对准聚光器中央 （ 如肉眼看不清标本所在位置，应先用低倍镜观察） ， 用移动器或用固定夹固定。眼睛从物镜侧面注视，右
2、手转动粗调节器，使载物台上升，油镜头慢慢浸入油中，并几乎与玻片接触，但切勿压及玻片，以防损坏油镜头。将聚光器升高，光圈开大，然后眼观镜筒内，两手转动反光镜采光，使视野内光线明亮。若光源为灯光或阴天采自然光时，则使用凹面镜。眼观镜筒内，右手持粗调节器，缓慢下降载物台，当看到模糊物象时，再用细调节器调整看清物象。操作时严防油镜头与玻片相撞。（三 ）油镜的保护显微镜是贵重精密仪器，使用时要精心保护，不得随意拆散和碰撞。取送显微镜时，右手持镜臂，左手托镜座，平端于胸前，然后轻放于桌面上或柜箱内。油镜用毕，载物台下降，取出标本片，用擦镜纸将油镜上的油擦净，（用擦镜纸蘸二甲苯擦试，再用擦镜纸擦去二甲苯）擦
3、镜时应顺其直径方向擦，不要转圈擦。不用时，将镜头转离聚光器，油镜头朝前呈 八”字形，降下聚光器，对号放入镜箱。标本片按规定擦去镜油，放入标本盒，如该标本片不再使用，则投入消毒缸内。防止与强酸、强碱、乙醴、氯仿、酒精等化学药品接触。（四）油镜加油的原理由于细菌个体小，必须使用90X或100X的物镜，以保证足够的放大倍数, 同时为保证足够的亮度，必须滴加香柏油（因香柏油与玻璃的折光率相近似），由 聚光器出来的光线通过玻璃和镜油， 不发生折射，直接进入镜筒，光路见下图所油镜加油的原理二、细菌不染色标本检查法【材料】变形杆菌、葡萄球菌（812h）肉汤培养物。凹玻片、载玻片、盖玻片、凡士林、接种环、酒精
4、灯。【方法】压滴法取一张洁净载玻片，用接种环取葡萄球菌和变形杆菌幼龄菌液各 23环, 分别置于玻片二端，加盖玻片，先用低倍镜对光，再用高倍镜观察细菌动力形态。 由于不是染色标本，光线宜暗，即降低聚光器，缩小光圈。悬滴法在凹玻片的凹窝周围涂少许凡士林，用接种环取变形杆菌和葡萄球菌菌液， 分别置于一盖玻片中央，将凹窝对准盖玻片反扣在盖玻片上， 将二者压紧后迅速 反转，使菌液悬于盖玻片。静置片刻后，先用低倍镜，再换高倍镜观察。观察时 光线不宜过强，适当降低聚光器，缩小光圈，以利观察。悬滴标本的制作暗视野法取下显微镜上原有的明视野聚光器，换装暗视野聚光器；取23环菌液置于载玻片上，加盖玻片（同压滴法）
5、；在暗视野聚光器上加镜油；置标 本片于载物台上，上升聚光器，使其上面的镜油与载玻片接触；转动反光镜， 使光线集中于聚光器上；用低倍镜观察，当视野中有一圆形光环出现时， 转动 聚光器上的调节螺旋，将光环移至视野中央；换高倍镜观察，用细调节器调节 清晰；若用油镜观察，则在盖玻片上加镜油。【结果】有鞭毛细菌运动的特点是：有明显的定向运动，从一处泳至另一处（变形杆 菌）。无鞭毛细菌运动的特点是：呈原位的颤动，为环境中液体分子冲击造成（葡萄球菌）二、2耐的基本形态观察（绘图）注意细菌勺大小（放大倍）、形状、00（葡萄球菌 链球菌埃布国00（白喉棒状杆菌 炭疽芽胞梭菌门螺杆菌四、细菌的特殊结构观察（绘图）
6、荚膜 芽胞O O肺炎链球菌 破伤风芽胞梭菌（注意荚膜和菌体） （注意芽胞的形状和住排列、染色性。30脑膜炎尔瑟宙大肠DO霍乱弧菌幽鞭毛O伤寒沙门菌置）（注意鞭毛的位置、数0量）五、细菌涂片的制作【目的】细菌材料须涂布固定于玻片上，经染色后才能观察其形态、结构及染色反 应。【原理】细菌的化学成分以胶体原浆蛋白为主，涂布在玻片上经火焰温热后可固定 于玻片，再经染色冲洗即可被染上颜色，且不易被水冲洗掉。【材料】接种环、酒精灯、火柴、葡萄球菌、大肠埃希菌培养物、玻片、生理盐水、 消毒缸。【方法】葡萄球菌大肠埃（1）涂片：于洁净载玻片两端各加一接种环生 希菌 理盐水；以无菌操作法，分别将二种细菌涂布于盐
7、水1（如取肉汤培养物涂片，则载玻片上不必加生理盐水干燥：让所涂标本自然干燥或于火焰高处烘干，但切 勿将涂膜烤焦。固定：将标本通过火焰三次（涂有标本的一面朝上）。细菌涂片制作【注意事项】玻片要洁净无油，否则菌液不易涂开。不宜选用厚玻片，以免观察时视野 难以调泊。取菌量宜少，涂片要匀而薄。水洗时要以细流水徐缓冲洗，避免直接冲洗 涂菌处，切勿将未经火焰固定的标本立即染色水洗。六、革兰染色【材料】葡萄球菌、大肠埃希菌培养物。革兰染色液：结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、稀释复红。接种环、酒精灯、载玻片、强光灯、显微镜、香柏油 （镜油）及拭镜纸等。 【方法】将细菌标本固定后，先用结晶紫（或龙胆紫）初染，再加
8、碘液媒液，此时各 种细菌均被染成深紫色。然后用 95%乙醇脱色，其中有的细菌脱去紫色，有的 仍然保持紫色。最后用沙黄（或复红）液复染。通过革兰染色将细菌分成两大类： 不被乙醇脱色仍保留紫色者为革兰阳性菌 （G+）;被乙醇脱色后再被复染成红色 者为革兰阴性菌（G）。细用涂块目此结晶紫染液+ 马口日日木十（1min）水洗水戈碘液 水诲95%乙醇本洗稀释复红 小仆(1min)（约30秒）(30 秒)【注意事项】不可使染液要掌握好染色时间，尤其是酒精脱色时间，不宜过长或过短, 干涸。选用适龄培养物，以1824小时为宜，否则影响染色效果。细菌染色标本观察后应放入指定的玻片缸中，以便消毒处理。【镜检结果】正确使用油镜观察结果并绘图。大肠埃希呈色 为革兰【思考题】1 .如何识别油镜头？使用油镜时应注意哪些事项？2 .对革兰染色的成败你有何体会？3 .革兰染色有何临床意义？