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1、CRISPR说明书用于CRISPR基因组编辑的一体式载体系统使用GeneArt? CRISPR核酸载体试剂盒进 行转染、富集、筛选并发表研究成果。GeneArt?规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）核 酸系统是简单、即用的多功能表达载体系统，同时包含用于快速、高效克隆靶向特异性crRNA的Cas9 核酸表达框架和gRNA框架。此系统允许您以序列特异性方式，从单个质粒编辑和设计您所选 的遗传位点。通过GeneArt? CRISPR鉴定相关靶标后，可采用GeneArt? Precision TAL 验证生物相关突变，以降低潜在的脱靶儿率。现以两种形式供应：1.内置即用型试剂 盒2.定制三组分的
2、CRISPR编辑基因组编辑采用人工核酸结合源性修复机制来改变细胞内的DNA。CRISPR/Cas系统充 分利用了短gRNA的优势来靶向细菌Cas9核酸内切酶、定位遗传位点。由于gRNA能够提 供特异性，更改靶标时，仅需要更改gRNA序列编码的设计。基因编辑中所用的CRISPR/Cas系统包含三种组分：Cas核酸Cas9 （双链DNA核酸内 切酶）、一种靶向补充物crRNA以及一种辅助反式激活因子crRNA （图1）。GeneArt? CRISPR核酸教体的crRNA和tracrRNA都以gRNA的方式一同表达，其中gRNA则在细菌系 统中模仿天然的crRNA-tracrRNA嵌合体。所有需要做
3、的工作就是引入一个编辑所需的序 列的双链寡核甘酸，以表达契合体的crRNA部分。图1. CRISPR/Cas9靶向的双链断裂。双链上均出现断裂，发生在靶向序列3端NGG 前间区序列邻近基序（PAM）序列的3碱基对上游。GeneArt? CRISPR核酸载体试剂盒GeneArt? CRISPR核酸教体试剂盒是用于表达哺乳动物细胞内CRISPR/Cas基因组编辑 所需功能组分的报告基因载体系统。这一系列试剂盒现提供有不同的报告基因：带有OFP （橙色荧光蛋白）的GeneArt? CRISPR核酸载体,支持Cas9和CRISPR RNA表达细胞群的 流式细胞术分选（FACS）（图2A）：带有CD4的
4、GeneArt? CRISPR核酸载体，支持微珠法 Cas9和CRISPR RNA表达细胞群富集（图2B）。线性化GeneArt? CRISPR核酸载体可提供快速、高效的双链寡核甘酸克隆方法，可将 编辑crRNA （代表所需的靶标）的双链寡核酸克隆进可对Cas9进行序列特异性靶向的表达 框架中。图2. GeneArt? CRISPR核酸酶载体图谱。使用预线性化的教体（带有5个碱基对突 出末端），轻松克隆编码靶点特异性crRNA的双链DNA寡核仃酸。图谱为带有（A） OFP报 告基因和（B） CD4报告基因的载体。gRNA、Cas9和报告基因均通过相同我体表达。Cas9 通过核定位信号靶向细胞核
5、（NLS1和NLS2） o采用一组GeneArt?基因组剪切检测试验测定基因修饰效率切割效率可采用GeneArt?基因组切割检测试验进行检测，这一技术采用错配检测内切 酶方法来检测胞内NHEJ修复期间因合并插入和/或切除而产生的插入或缺失。图3. CRISPR/Cas9介导的切割效率。采用GeneArt?基因组切割检测试验（计划于 2021年1月发布）研究HPRT位点时的凝胶图像。（A）采用表达HPRT特异性CRISPR RNA 的GeneArt? CRISPR核酸0FP毂体获得的结果。（B）采用表达HPRT特异性CRISPR RNA的 GeneArt? CRISPR核酸CD4教体获得的结果。
6、在转染进HeLa细胞后，进行三联切割试验， 并计算插入或缺失的百分比。富集表达Cas9和gRNA的细胞群由于Cas9基因与OFP或CD4连接，使用GeneArt? CRISPR核酸多功能我体系统时的 使用效率可采用荧光显微镜或FACS （如为含有OFP的质粒），或采用抗CD4荧光抗体（如 为CD4质粒）进行监测。图7.表达Cas9和gRNA的细胞群的富集。（A）使用靶向RelA位点的GeneArt?CRISPR核酸OFP载体编码的crRNA时，在293T细胞中的沾染效率。数据显示，感染的样 本中含有超过90%的OFP阳性细胞。（B） GeneArt? CRISPR核酸CD4载体的CD4功能。293 FT细胞转染了 AAVS1特异性的GeneArt? CRISPR核酸CD4教体。采集细胞并采用抗CD4 FITC抗体染色，之后采用流式细胞仪进行分析以测定转染效率。一部分染色的细胞还被接 种到一个平板上，以便采用荧光显微镜进行分析。感谢您的阅读，祝您生活愉快。