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1、表达载体一、原核细胞表达载体1. pBAD 载体 :特点; 该表达质粒含有 araBAD (arabinose) 操纵子的 PBAD 启动子和编码该启 动子的正负调控子基因araC,具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原 核细胞表达载体.1. 当要扦入其他信号肽片段,改建此载体时,请不要利用该载体上的 Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1 和 Pst1 位点,以免造成重组困难,由于前述内切酶在 此载体上均有二个位点,最好使用只有一个酶切位点的 Sac1 和 Hind111 位 点.同时记住,如在 不含任何信号肽的 PBAD 表达质粒扦入信号肽,其非编 码N-末端要包含核糖体结合位点(
2、RBS)核苷酸序列.2 在使用 含 Omp A 分泌信号肽的 PBAD 表达质粒时,请应用 Omp A 分泌 信号肽上的 Sac1 以及载体 Hind111 酶切位点,这些在载体序列上都是单个 酶切位点.精品资料Name: pBADPACYC184ori.本公司目前有 含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种 PBAD表达质粒, 其多克隆位点区域图谱如下：(a)、含Omp A分泌信号肽的PBAD表达质粒多克隆区域SDP BAD .TACCCGTTTTTTTCC .GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CT
3、G GCTGGTA M A E LTTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNco1Sac1 Kpn1 Small BamHIPst1111(b)、不含分泌信号肽的PBAD表达质粒多克隆区域EcoR1Kpn1BamH1Pst1P BAD .TACCCGTTTTTTTGG.GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNde1Sac1Smal 1Hi nd111下列图显示本公司应用表达载体完成的实验结果
4、MEd廿泌到堆胞垢养蔽中的歪达蛊白产物4PA*第一道- 第二1S和第三道分别光去白蘭孙予标准駭、力卜时利小时 诱导的花P典产物pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞Origami(DE3)内高效表达2. pCAl-n & pCAl- pelB 载体特点：该原核细胞表达载体是来源于以 T7 RNA聚合酶为根底的pET载体, 含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序 列.因此,该表达载体在E.coli BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS 宿主菌中能 高水平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和 凝血酶切点,故该蛋白产物易于纯化和产业
5、化.此外,本公司利用分泌信号肽PelB,构建成新型的的原核细胞表达载体Pcal- PelB.此载体表达的蛋白产物能在分泌肽 PelB的指引下进入细胞周质.精品资料Name- Pcahi vedoi1.Pcal-nM K RRWKKNCATATG_|GGACGATGGAAAAAACAATTTCATAGCCGTCTCAGCAGCCAACCCGCTTTAAGAAAATCTCATCCTCCGGGGCACTTCTGGTTCCNde1RGSP GILDS MGRLELKLRSAGCGTGGATCCCCGGGAATTCTAGACTCCATGGGTCGACTCGAGCTCAAGCTTAGATCCGCCBamH
6、I Sma1 EcoRINco1 Sall Xhol Sac1 Hnd111(b). Pcal- PelB:Nde1 actggagac: cat atg aaa tac cta ttg cct acg gca gcc gct gga ttg tta tta ctc gcg gcc cagGGCM K Y L L P T A A A G L LLLAAQPNco1 Msc1 BamH1EcoR1Sal1agagcccgcc atg gccaa ggatcc taagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtctcgacgcgctgggAMA*3. pPOW3.0
7、表达载体精品资料Ncol Msc1BamHIEcoRISallPrPlggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggcgcc动tcgagtaatttaccaacactactacgttttaactgaaacaa特点：该原核表达质粒含有噬菌体的重叠 ？PrPl热诱导启动子和编码热敏 感抑制子的C1857基因,可使宿主细胞在合成蛋白前获得高密度的宿主细 菌,进行高水平目的蛋白表达,并对蛋白合成提供紧密限制.PelB分泌信号肽能指引合成的外源蛋白通过胞浆膜进入胞质.特别提示：在进行重组质粒时,最好在 N-未端用Ncol或Msc1位点,C-末端那么可用BamHI、 EcoRI位点进行拼接.N
8、ame: pPOWS.OPHJPLlamHireSTpPOW3,05000bpfd tenTiinut口i*Ampicillin resistanceCui El ami图示为启动子、PelB分泌信号肽和多克隆位点区域Xho1RBS Nde1 actggagac: catATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTCGCGM K Y L L P T A A A G L L L L AGCCCAGGGCGCCATGGCCaa ggatcc taagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtct
9、 agagcccA Q P AMA*说明：RBS为核糖体结合位点；*为终止密码子、真核细胞表达载体1. pCMVp-NEO-BAN 载体特点：该真核细胞表达载体分子量为 6600碱基对,主要由CMVp启 动子、兔3球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成,在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外 源目的基因.更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后,用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株.扦入外源基因的克隆位点包括 Sal1、BamH1和EcoR1位点.注意在此载 体中有二个EcoR1位点存在.精品资料Name:
10、pCMVp-NEOBAM2. pEGFP,增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhan ced Fluorece nt Protein Vector)特点：pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下, 在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、 Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号 组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.此外,载体中的pUCorigin能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动k
11、anamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达.用途：该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,借此将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因.可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位.亦可用于检测克隆的启动子活性取代CMV启动子,Acet1-Nhe1Excitati on maximum = 488 nm; Emissi on maximum = 507Name: pEGFPAsdlBl精品资料图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域:NhelAgelAse1.eta ccg gtcgcc ace3. pEGFT-Actin,增强型绿色荧光蛋白/人
12、肌动蛋白表达载体特点：pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆怜肌动蛋白基因,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达.载体骨架中 的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因 以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用 G418筛选稳定转染的真 核细胞株.此外, 载体中的pUC origin能保证该载体在大肠杆菌中的复 制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达.用途：pEGFP-Actin载体在真核细
13、胞表达 EGFP-Actin融合蛋白,该蛋 白能整合到胞内正在生的肌动蛋白,因而在活细胞和固定细胞中观察到细 胞内含肌动蛋白的亚细胞结构.Name: pSV2Emissi on maximum = 507CMVIhB 11592)I ISV TK poly AEGFPKan/Neo resistancepEGFP-Adin5$0Dbpr AclnnExcitati on maximum = 488 nm;Name: pEGFP-Actin精品资料A+Stul3EErSV40 ori图示为启动子和多克隆位点区域:.Agel .EGFP Bgl11 Actin BamHI SV40 poly4.
14、pSV2表达载体特点：该表达质粒是以病责 SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进 行表达的,克隆位点为 Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异 性.此载体不含neo基因,故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株.图示为启动子和多克隆位点区域:Pvu11 .Hindlll .SV40 IVSSV40 polyA+5. CMV4表达载体特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动,多克隆区域酶切位点选择性较多.含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点.但值得注意的是,该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株.Name: p
15、CMV4II on图示为启动子和多克隆位点区域：CMVp Bgl11 -Kpn1 Mlu1 Clal Hind111 Xball Smal GH,SV 4.ori |其他常用克隆Vector:pBluscript II KS DNA15 ugpUC18 DNA25 ugpUC19 DNA25 ug产品说明：pBluescript II kS、pUC18 & Puc19载体适合于 DNA 片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等.这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点,当外源 DNA片段扦入,转化保存液：TE BufferlacZ基因缺乏细胞,并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养：时,含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落,而无外源DNATE Buffer组成:片段载体的细胞那么为兰色菌落,由此易于筛选有无外源DNA片段的载体.此外,这些载体中有便于测序的 M13、10 mM Tris.HCL(Ph 8.0)T7和T3的通用引物进行DNA测序.1 mM EDTA用途：?克隆外源DNA片断.?进行基因表达.?使用M13 T7和 T3引物进行测序.精品资料精品资料Welcome ToDownload !欢送您的下载,资料仅供参考！