HIV病毒检测方法及其检测试剂盒.docx

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1、（54）发明名称HIV病毒RT-LAMP-LFD 检测方法及其检测试剂盒 （57）摘要本发明公开了一种 HIV病毒RT-LAMP-LFD 检测试剂盒及其检测方法。该检测方法是 根据GenBank公布的HIV病毒序列的保守区域设计HIV RT-LAMP-LFD反应系统所需引物与探针；采用本发明人配制的RNA提取试剂提取HIV病毒RNA ,使用本发明建立的RT-LAMP反应体系进行检测，依据反应体系加入的检测探针，在反应结束后利用核酸快速 检测试纸判定结果。同现在 HIV病毒的常用检测技术相比，本发明有助于实现早期诊断，避免漏检，有助于提高检测的灵敏性、缩短检测时间，是 HIV诊断方法持续发展的主

2、 要方向。1 .一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法，其特征在于包括如下步骤：（HIV 病毒）RNA的提取：取20-35mg含有HIV病毒的血液 组织，加入300-500U L裂解液匀浆，离心；（2）取步骤（1）离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；（4）用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA;配制预反应液，所述预反应液体积为15-20 u L ,包括：1.5-2.0mmol /L引物 HIV-FIP,1.5-2.0 mmol/L 弓I 物 HIV-BIP ,0.2mmol

3、/I 弓I 物 HIV-F3,0.2 mmol/1 弓I 物 HIV-B3 ,0.05-0.20umol /L 探针 HIV-FITC-PROBE ,15-30mmol/L.pH8.5-9.5 的 Tris-HCl ,10-25mmol/I 氯化钾，10-25 mmol/1 硫酸俊，5-l5mmol/I 硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100, 0.4-0.9mo1/I 甜菜碱,1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U 逆转录酶 AMV, 5-15U BstDNA 聚合 酶大片段 引物HIV-FIP序列 见SEQ ID N0 :1 ,引物HIV-BIP序列见SEQ ID

4、 N0 :2 ,引物 HIV-F3 序列见 SEQ ID N0:3 ,引物 HIV-B3 序列见 SEQ ID NO:4 ,探针 HIV-FITC-PROBE 序列见SEQ ID N0 :5（6）在16-25 u L预反应液中加入4-10 u L步骤（4）所得RNA作为模板，控制反应体系总 体积为20-25 u L然后在温度为 60-65 C,反应15-65 min；LFD试纸中测：（7）取步骤（6）所得LAMP扩增反应产物6-10 u L滴到LFD试纸的点样处，然后在 点样处前端滴上 60-100 uL缓冲?C 5-20分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。2 .根据权利要求1所述的（HI

5、V RT-LAMP-LFD检测方法），其特征在于：所述裂解液包括浓度 为30-60mmol/L的pH7.3-7. 6的Tris-HCl ,浓度为3-6mol/L的异硫氧酸帆以及浓度为 5-10mmol /L.EDTA.3 .根据权利要求1所述的（HIV RT-LAMP-LFD检测方法），其特征在于：所述去蛋白液包括浓 度为10-50mmol/L的pH7.3-7. 6 Tri s-HCl ,浓度为0. 4-0. 6mol /L异硫鼠酸月瓜，以及体积浓 度为15-30%的无水乙醇。4 .根据权利要求1所述的（HIV RT-LAMP-LFD检测方法），其特征在于：所述漂洗液包括浓度 为 10-50m

6、mol/L 的 pH7.3-7.6 Tris-HCL,55-150 mmol/LNaCl ,以及体积浓度 75% 的无水乙醇。5 .根据权利要求1或2或3或4所述的（HIV RT-LAMP-LFD 检测方法），其特征在于：引物 HIV-FIP为5端生物素标记引物；探针MIV-FITC-PROBE 为5端FITC标记探针：6 . 一种HIV病毒RT-LAMP-LFD 检测试剂盒，其特征在于：包括 RT- LAMP扩增反应液， 16-20u L 的 RT- LAMP 扩增反应液包括:1.5-2.0mmol /L 引物 HIV-FIP,1.5-2.0 mmol/L 引物 HIV-BIP ,0.2mm

7、ol/I 弓I 物 HIV-F3,0.2 mmol/1 弓I 物 HIV-B3 ,0.05-0.20umol /L 探针HIV-FITC-PROBE ,15-30mmol/L.pH8.5-9.5 的 Tris-HCl , 10-25mmol/I 氯化钾，10-25 mmol/1硫酸俊，5-l5mmol/I 硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100, 0.4-0.9mo1/I 甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶 AMV , 5-15U BstDNA 聚合酶大片段，其余为 RNase firee water.引物 HIV-FIP 序列见 SEQ ID N

8、0 :1,引物 HIV-BIP 序列见 SEQ ID N0 :2,引物 HIV-F3 序列见 SEQ ID N0:3,引物 HIV-B3 序列见 SEQ ID NO:4，探针 HIV-FITC-PROBE 序列见 SEQ ID N0 :57 .根据权利要求6所述的HIV RT-LAMP-LFD 检测试剂盒，其特征在于：引物HIV-FIP序列 见 SEQ ID N0 :1 ,引物 HIV-BIP 序列见 SEQ ID N0 :2 ,引物 HIV-F3 序列见 SEQ ID N0:3 , 引物 HIV-B3 序列见 SEQ ID NO:4 ,探针 HIV-FITC-PROBE 序列见 SEQ ID

9、 N0 :58.根据权利要求6所述的HIV RT-LAMP-LFD 检测试剂盒，其特征在于：HIV病毒LAMP-LFD 检测试剂盒 还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中 LFD试纸用的缓冲液为1xTAE缓冲液，阳性对照样品为 HIV基因组病毒RNA ,阴性对照样品为无核酸 的 RNase firee waterHIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒技术领域000l本发明涉及哺乳动物病毒检测领域，特别涉及一种人体HIV病毒RT-LAMP-LFD 检测方法及其检测试剂盒。背景技术0002 HIV即人类免疫缺陷病毒（ Human Immunodeficienc

10、y Virus , HIV）,顾名思义它会 造成人类免疫系统的缺陷。1981年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒（Lentivirus ）,属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传 染病。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病（获得性免疫缺陷综合征）0003研究表明，人类免疫缺陷病毒直径约 120纳米，大致呈球形。病毒外膜是类脂包膜， 来自宿主细胞，并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41; gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并与gp41通过非共价作用结合。向内是由蛋白p17形成

11、的球形基质（Matrix）,以及蛋白p24形成的半锥形衣壳（Capsid）,衣壳在电镜下呈高电子密度。衣壳内含有病毒的 RNA基因组、酶（逆转录酶、整合酶、蛋白酶）以及其他来自宿主细胞的成分。其序列已测定并在 GenBank上登录（登录号分别为 AY222839, AY222840 ）。目前该病毒的检测方法 有电镜法、RT-PCR检 测法、TAS-FLTSA检测法等，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是灵敏度小，无法检测到 潜伏感毒样品；二是容易产生 假阳性，对模板质量要求高；三是操作繁琐， 对实验条件要求高。0004 RT-LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介

12、导等温核酸扩增技术的 原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，利用一种具有链置换特性的DNA聚合酶和AMV逆转录酶的同时作用下，使RT和LAMP反应在同管中同时进行，简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料观察等方法。0005侧向流层析试纸（lateral flow dipstick, LFD）是一种检测产物的新方法，利用反应体系中的FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，减少了电泳环节、染料颜色的人为目测差异以及由非特异性扩增造成的假阳性问题.LFD检测相对于其他检测手段，有操作简便且安

13、全的特点。LAMP-LFD反应结果可以直接肉眼观察。LFD试纸上有质控带和检测带，两条带都显色表示阳性，只有质控带而检测带未显色表明检测结果为阴性。该方法具有安个、快捷、高效、高灵敏度且无高的实验条件要求，适合应用推广。目前，该技术在 艾滋病病毒(HIV)的检测中未见报道。 发明内容0006本发明的目的在于是提供一种应用环介导恒温扩增技术结合色谱侧向层析试纸 来检测艾滋病病毒(HIV)的方法，特异性强，敏感率高。0007本发明另一目的在于提供一种用于上述方法的检测试剂盒，该试剂盒特异性强，敏感率高，而且操作简便快捷，克服现有检测方法不能在检查中直接应用的问题，适合艾滋病病毒(HIV)的筛查与预

14、防。0008本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种艾滋病病毒(HIV)RT-LAMP-LFD 检测方法，包括如下步骤： 病毒RNA的提取：取20-35mg含有HIV病毒的血液 组织，加入300-500裂解液匀浆，离心；(2)取步骤(1)离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；(3)依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；(4)用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA;所述预反 应液体积 为15-20 u L ,包括：1.5-2.0mmol /L弓I物 HIV-FIP,1.5-2.0 mmol/L 弓I 物 HIV-BIP ,

15、0.2mmol/I弓I 物 HIV-F3,0.2 mmol/1弓I 物HIV-B3 ,0.05-0.20umol /L 探针 HIV-FITC-PROBE ,15-30mmol/L.pH8.5-9.5 的 Tris-HCl ,10-25mmol/I 氯化钾，10-25 mmol/1 硫酸镂，5-l5mmol/I 硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100, 0.4-0.9mo1/I 甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U 逆转录酶 AMV, 5-15U BstDNA 聚合 酶大片段 引物HIV-FIP序列 见SEQ ID N0 :1 ,引物HIV-BIP序列见SE

16、Q ID N0 :2 ,引物 HIV-F3 序列见 SEQ ID N0:3 ,引物 HIV-B3 序列见 SEQ ID NO:4 ,探针 HIV-FITC-PROBE 序列见SEQ ID N0 :5(6)在16-25 u L预反应液中加入4-10 u L步骤(4)所得RNA作为模板，控制反应体系总 体积为20-25 u L然后在温度为 60-65 C,反应15-65 min；LFD试纸本测：(7)取步骤(6)所得LAMP扩增反应产物6-10 u L滴到LFD试纸的点样处，然后在 点样处前端滴上 60-100 uL缓冲?C 5-20分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。0009本发明的检测方法

17、是根据GenHank公布的艾滋病病毒(HIV)序列的保守区域设计了HIV病毒RT-LAMP-LFD 反应系统所需引物与探针；病毒RNA提取病毒RNA ,使用本发明建立的RT-LAMP-LFD反应体系进行检测，依据反应体系中加入的检测探针，在反应结束后利用核酸快速检测试纸判定结果，结果显示在61C 30min, HIV病毒RNA获得了高效特异性扩增。同现在 HIV病毒的常用检测技术相比，本发明有助于实现早期诊断，避免漏检，有助于提高检测的灵敏性、缩短检测时间，是 HIV诊断方法持续发展的主要方向。0010作为优选，所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L的pH7.3-7. 6的Tris-HCl

18、 ,浓度为3-6mol/L的异硫鼠酸月瓜，以及浓度为 5-10mmol /L.EDTA.0011作为优选，所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7. 6 Tri s-HCl ,浓度为0. 4-0.6mol /L异硫氟酸月瓜，以及体积浓度为15-30%的无水乙醇。0012作为优选，所述漂洗液包括浓度为 10-50mmol/L 的 pH7.3-7.6 Tris-HCL,55-150 mmol/LNaCl ,以及体积浓度 75%的无水乙醇。0013作为优选，引物 HIV-FIP为5端生物素标记引物；探针HIV-FTIC-PROBE为5 端FTIC标记探针。0014 一种HIV病毒

19、RT-LAMP-LFD 检测试剂盒，其特征在于：包RT- LAMP扩增反应液， 16-20u L 的 RT- LAMP 扩增反应液包括：1.5-2.0mmol /L 引物 HIV-FIP,1.5-2.0 mmol/L 引物 HIV-BIP ,0.2mmol/I 弓I 物 HIV-F3,0.2 mmol/1 弓I 物 HIV-B3 ,0.05-0.20umol /L 探针 HIV-FITC-PROBE ,15-30mmol/L.pH8.5-9.5 的 Tris-HCl , 10-25mmol/I 氯化钾，10-25 mmol/1硫酸镂，5-l5mmol/I 硫酸镁，0.15-0.35%Trito

20、n X-100, 0.4-0.9mo1/I 甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶 AMV , 5-15U BstDNA 聚合酶大片段，其余为 RNase firee watero引物 HIV-FIP 序列见 SEQ ID N0 :1,引物 HIV-BIP 序列见 SEQ ID N0 :2,引物 HIV-F3 序列见 SEQ ID N0:3,弓 I物 HIV-B3 序列见 SEQ ID NO:4，探针 HIV-FITC-PROBE 序列见 SEQ ID N0 :50015作为优选，弓I物 HIV-FIP为5端生物素标记引物；探针HIV-FTIC-PROBE 为5端F

21、TIC 标记探针。0016作为优选，HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒 还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对 照样品和阴性对照样品， 其中LFD试纸用的缓冲液为1 x TAE缓冲液，阳性对照样品为 HIV 病毒基因组 RNA ,阴性对照样品为 无核酸的RNase firee water0017本发明的有益效果是：1、本发明所采用引物组是根据HIV衣壳蛋白基因 的六个不同区域设计的，又有RNA的特异性探针相结合，特异性比常规 PCR强。00182、本发明的检测试剂盒检测灵敏度高，是常规 PCR的102-103倍。00193、本发明的检测试剂盒检测时间短，可以在 30-60min内获得检测结

22、果，比常规PCR节约3.5-4.5小时。00204、本发明的检测试剂盒对仪器设备要求低，不需要普通 PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统。00215、本发明中的病毒 RNA提取方法简单快捷，而且不用到氯仿、疏基乙醇等有害物质。00226、本发明的检测试剂盒操作步骤简单，结果直观易判定。00237、本发明的检测试剂盒对人和环境较安，整个过程不使用有毒物质。0024附图说明0025图 1 为扩增温度对 RT-LAMP 反应的影响图 M:100bp DNA Ladder Marker（TaKaRa 公司）;泳道1:61 C恒温条件下扩增结果；泳道2 :63C温度条件下扩增结果；泳道3:65C温度

23、 条件下扩增结果。0026图 2 为 MrNV RT-LAMP特异性实验结果。M:100bp DNA Ladder Marker（TaKaRa公.d）;泳道1:罗氏沼虾野田村病毒;泳道2:南美白对虾白斑综合症病毒（WSSV）;泳道3:草鱼呼肠孤 病毒（GORV;泳道4:对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV;泳道5:对虾桃拉病毒（TSV）;泳道6:阴性对照。0027图3为本发明的检测方法检测感染MrNV样品实验结果图。M :100bp DNA ladderMarker（TaKaRa 公司）;左侧泳道1: MrNV 样品RT-LAMP 反应：30min。检测结果；左侧泳 道2:MrNV样品

24、RT-LAMP反应45min检测Z果；NT:为阴性对照样品检测结果：右侧为LFD 试纸检测显色结果。0028图4为本发明的检测方法检测 MrNV的灵敏度比较图和 LFD试纸显色又#匕图。M: 100bp DNA ladder Marker（TaKaRa 公司）;左侧泳道 1-6:模板分另为 10-1,10-2,10-3,10-4,105,106 倍稀释的基因组 RNA;泳道7:无模板；右侧1-7:为左侧实验结果的 LFD试纸检测图。具体实施方式0029下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。0030本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常

25、用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。0031本发明实施如下：一种艾滋病病毒HIV-RT-LAMP-LFD 检测方法，包才如下步骤 ：病毒RNA的提取：(1)取20-35mg含有HIV病毒的血液组织，加入300-500U L裂解液匀号离心； (12000rpm 离心 1-2min)0032所述裂解液包括浓度为 30-60mmol/L的pH7.3-7. 6的Tris-HCl ,浓度为3-6mol/L的 异硫鼠酸月瓜，以及浓度为5-10mmol /L.EDTA.其余为 RNase free water。0033(2)取步骤(1)离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均

26、匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；将混合液与玻璃纤维素膜结合具体操作为：将混合液转入带有玻璃纤维素膜的吸附柱中，12000rpm离心1-2min,弃掉废液，这样混合液与玻璃纤维素膜就结 合。0034( 3)依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜。0035去蛋白液洗涤玻璃纤维素膜具体操作为：向吸附柱中加入 400-600 u L去蛋白液，室温静1-2min,12000rpm 离心30-60S,弃掉废液。0036所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7. 6 Tri s-HCl,浓度为0.4-0. 6mol/L异硫鼠酸月瓜，以及体积浓度为15-30%的无水乙醇。0037 漂洗液

27、洗涤玻璃纤维素膜具体操作为：向吸附柱中加入 400-600 u L漂洗液，12000rpm离心30-60S,弃掉废液，重复该步骤一次。0038 所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L 的 pH7.3-7.6 Tris-HCL,55-150 mmol/LNaCl ,以及体积浓度75%的无水乙醇。0039(4)用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA ,具体操作为：在吸附柱中加入30-50u L RNase free water(市售)，室温放置 1-2min,12000rpm 离心1-2min重复该步 骤一次，增加RNA洗脱量。0040 RT- LAMP 扩增反应：(

28、5)配制预反应液，所述预反 应液体积 为15-20 u L ,包括：1.5-2.0mmol /L弓I物 HIV-FIP,1.5-2.0 mmol/L 弓I 物 HIV-BIP ,0.2mmol/I弓I 物 HIV-F3,0.2 mmol/1弓I 物HIV-B3 ,0.05-0.20umol /L 探针 HIV-FITC-PROBE ,15-30mmol/L.pH8.5-9.5 的 Tris-HCl ,10-25mmol/I 氯化钾，10-25 mmol/1 硫酸镂，5-l5mmol/I 硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100, 0.4-0.9mo1/I 甜菜碱，1.5-1.8mm

29、ol/I. dNTP, 1-3U 逆转录酶 AMV, 5-15U BstDNA 聚合 酶大片段0041引物 HIV-FIP 序列见 SEQ ID N0 :1 ,引物 HIV-BIP 序列见 SEQ ID N0 :2,引物 HIV-F3 序列见 SEQ ID N0:3 ,引物 HIV-B3 序列见 SEQ ID NO:4 ,探针 HIV-FITC-PROBE 序列见SEQ ID N0 :50042 HIV-RT-LAMP弓|物、探针设计与筛选本发明所述的引物是根据GenBank公布的RNA2序列，由在线软件 PrimerExplorerV4 (http: primerexplorer.jp/e/

30、)设计和手工修改后获得，利用不同引物的反应结果进行筛选， 由其中选出两对引物和一条探针。0043引物 HIV-F3 (SEQ ID N0:3):GATACAACAACTATTCCA TTGATTG0044引物 HIV-B3 (SEQ ID N0:4)TGTAGGATTAA TTTGTGGCATG0045引物 HIV-FIP (SEQ ID NO :1):GCAAGAGGTAAAATACACCCTGTT-TACTATACTGGTCAAGATAAAGAGA0046引物 HIV-BIP (SEQ ID NO :2):AGTGGTGAAGCCATTACAAA TGA-GAAAA TCCACAGACCC

31、AATC0047探针 HIV-FITC-PROBE (SEQ ID N0 :5):CTCTTGCAAGTGACTACACTACTTAA0048其中 HIV-FIP 为 5端生物素(biotin)标记引物；HIV-FITC-PROBE 为 5端 FITC 标记探针。0049(6)在16-25 u L预反应液中加入 4-10 u L步骤(4)所得RNA作为模板，控制反应体系总体积为 20-25u L然后在温度为60-65 C,反应15-65 min；0050 LFD试纸检测：(7)取步骤(6)所得LAMP扩增反应产物6-10 u L滴到LFD试纸的点样处，然后在点样 处前端滴上60-100 uL缓

32、冲3夜,5-20分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。当仅出现 质控带时表明反应结果为阴性，当质控带和检测带同时出现时，表明 反应结果为阳性。0051 一种HIV病毒RT-LAMP-LFD 检测试剂盒，其特征在于：包括 RT- LAMP扩增反应 液，16-20u L 的 RT-LAMP 扩增反应液包括：1.5-2.0mmol /L 引物 HIV-FIP,1.5-2.0 mmol/L 引 物 HIV-BIP ,0.2mmol/I 引物 HIV-F3,0.2 mmol/1 引物 HIV-B3 ,0.05-0.20umol /L 探针 HIV-FITC-PROBE ,15-30mmol/L.pH8

33、.5-9.5 的 Tris-HCl , 10-25mmol/I 氯化钾，10-25 mmol/1硫酸镂，5-l5mmol/I 硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100, 0.4-0.9mo1/I 甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶 AMV , 5-15U BstDNA 聚合酶大片段，其余为 RNase firee water.0052引物 HIV-FIP 序列见 SEQ ID N0 :1，引物 HIV-BIP 序列见 SEQ ID N0 :2，引物 HIV-F3 序列见 SEQ ID N0:3,弓 I物 HIV-B3 序列见 SEQ ID NO:4，

34、探针 HIV-FITC-PROBE 序列见 SEQ ID N0 :50053 RT- LAMP扩增反应液装于 RT-LAMP核酸反应管中，RT-LAMP核酸反应管中添加 有稳定液，稳定液为液体石蜡油。稳定液滴加在 RT-LAMP核酸反应管中，用于液封，稳定 液用量在5-10 u L 。0054检测试剂盒还配有 LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD试纸用的缓冲液为 1x TAE缓冲液，阳性对照样品为HIV病毒基因组RNA,阴性对照样品为无核酸的 RNase free water0055本发明的上述方案在其范围内都是可以实施的，以下以一个典型实施方案来具体 说明本发明的具体

35、操作步骤。0056典型实施方案：1、材料被感染的人体HIV病毒细胞 采集自宁波第一医院；所用引物与探针由上海生工生物公司 合成；Bst DNA 聚合酶大片段购自New England BIPolabs公司：;逆转录酶 AMV , dNTP购自takara公司；甜菜碱、硫酸镁等购自sigma公司。0057 2、罗氏沼虾样品 病毒RNA的提取：(1)取20mg被感染的人体HIV病毒细胞组织，加入500 u L裂解液后用一次性研磨棒 研磨，等彻底匀浆后，12000rpm离心2min ,吸取上清液至新的离心管；(2)向装有上清液的新的离心管中加入等体积(与上清液等体积)的70%无水乙醇后，混合均匀；(

36、3)将混合液体转入带有玻璃纤维素膜的吸附柱中，吸附柱置于收集管中，12000rpm离心l min ,弃掉废液；(4)向吸附柱中加入 550 u L去蛋白液，室温静置 1min,12000rpm离心30s,弃掉废液； (5)加入600 u L漂洗液,12000rpm离心30s,弃掉废液；重复该步骤一次。0058 (6)将吸附柱置于新的无RNase的离心管中，在吸附柱中加入 50 u L RNase freewater,室温放置1min,12000rpm离心lmin。使用第一次的洗脱液重复该步骤一次，增加RNA洗脱量。0059 (7)取5 u L RNA洗脱液进行10-1 - 10-7的逐步梯度稀

37、释，-80C保存备用。0060 3、HIV 病毒 RT-LAMP 恒温扩增：(1)根据待检样品数，配制相应倍数的核酸检测的预反应液：1.5mmol/L 引物 HIV-FIP , 1.5mmol /L 引物 HIV-BIP, 0.2mmol/I 引物 HIV-F3 ,0.2mmol/L 引物 HIV-B3,0.05 u mol /L 探针 HIV-FITC-PROBE,14 mmol/l, pH8.0-9.0 的 Tris-HCl ,l0mmol/1 氯化钾，13 mmol/L 硫酸俊，6mmo1/L 硫酸镁，0.1% TritonX-100,0. 6mol /L 甜菜碱，7.4mmol/L d

38、NTP,1U逆转录酶AMV, 8U Bst DNA聚合酶大片段，其余为RNase free water每管检测预反 应液体积为26 uLo0061(2)分别吸取5u L小同浓度的待检样品RNA加入核酸检测反应管中，混合均匀。0062(3)标记清楚后，将检测反应管置于61c水浴锅中，反应 30min00634、HIV病毒RT-LAMP扩增产物进行凝胶电泳 ：(1)配置2%的琼脂糖凝胶，每个加样孔加入5uL的反应产物；(2)电泳30分钟后凝胶成像，结果见图3和图4左侧图。00645、RT-LAMP 扩增产物的 LFD试纸检测：(1)取HIV病毒RT-LAMP扩增产物5u L,置于LFD试纸加样孔；

39、(2)在LFD试纸加样孔一端，滴加 50uL缓冲液(1xTAE缓冲液)，待缓冲液移动基本结 束，判断RT-LAMP-LFD 检测结果，见图3与图4右侧图。0065利用本发明所述的检测试剂盒和检测方法检测人体HIV病毒，经过凝胶电泳，由图3左侧图可见阶梯状的扩增条带；再利用LFD检测试纸条检验扩增产物，由 图3右 侧图可见与电泳结果吻合。而 图2特异性实验结果和 图4灵敏度检测结果表明本检测方法 具有较好的特异性和灵敏度。其中图1为筛选本体系最佳的反应温度，如图所示温度 61C较佳。0066根据以上实验Z果表明，HIV病毒RT-LAMP-LFD 检测试剂盒和检测方法可以为 艾滋病病毒HIV提供快速、简便、灵敏的现场检测。0067以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的 限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。