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1、不同的PCR技术聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）简称PCR,是一种分子生物学 技术，用于放大特定的DNA片段，可以看作是生物体外的特殊 DNA复制。工 作原理：PCR由变性-退火（复性）-延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA 的变性：模板DNA经加热至90-95l定时间后，使模板 DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作 准备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板 DNA经加热变性成单链后， 温度降至50-60，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 物的延伸： DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作
2、用下，于70-75,以dNTP为反应原 料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的 平保 留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。实验材料：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、 耐热DNA聚合酶-Taq 酶、dNTP、模板和Mg2+1,引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物 与模板DNA互补的程度。引物长度：15-30bp,常用为20bp左右；引物扩增跨 度以200-500bp为宜，特定条件下可
3、扩增长至10kb的片段；引物碱基G+C含量 以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免5个以上的喋吟或喀呢核甘酸的成串排列； 避免引物内部出 现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体， 产生非特异的扩增条带；引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严 格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量：每条引物的浓度 0.11umol
4、或10100Pmol,以最低引物量产生所需 要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。2,目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成 产物量减少。3, dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系， dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的缓冲液将其PH调节到 7
5、.07.5,小量分装，-20OM冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中， dNTP应为50200umol/L ,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过 低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。4,模板（靶基因）核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关 键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞 膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；
6、蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白 质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR反应。RNA模板提取一般采用异硫鼠酸月瓜或蛋白酶 K法，要防止RNase降 解 RNA 05, Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为 宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。注意：PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般
7、1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。34kb的靶序歹需34min；扩增 10Kb需延伸至15min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度 模板的扩增，延伸时间要稍长些。RT -PCR （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction 即逆转录-聚合 酶链式反应。原理是：提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板， 采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA,再以cDNA为模板进 行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR使RNA检测的灵敏性 提高了几个数量级，使一些极为微量
8、RNA样品分析成为可能。该技术主要用于： 分析基因的转录产物、获取目的基因、合成 cDNA探针、构建RNA高效转录系 统,也可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中 RNA病毒的含量。注意：我们提取的RNA主要是rRNA,即核糖体RNA,但很少有人用它做 些什么，倒是含量较少的 mRNA,即信使RNA是中心法则所述的遗传信息表现 的中转站，所以我们要把微量的信使 RNA提出来，更重要的是，RNA太容易分 解了，环境中无处不在的RNA酶，以及其容易被水解的特点，需要尽快把信使 RNA转化成稳定的形式，于是就有了 RT-PCRo实时荧光定量PCR (Quantitative Rea-time PCR)
9、是一种在DNA扩增反应中， 以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。 Rea-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。 由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系， 所以成为定量的依据。原理：将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性， 低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板 DNA互补配 对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光， 随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长， 通过实时检测与 之对应的随扩增而变化荧
10、光信号强度，求得 Ct值，同时利用数个已知模板浓度 的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。检测方法：1.SYBRGreendM:在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地 掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR染料分子不会发射任 何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。2.TaqMan探针法:探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不发光； PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基 团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。Ct值（Cycle threshold,循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的 Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始 拷贝数。