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1、ctDNA检测技术循环月中瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)来源于月中瘤细胞的凋亡、坏死 或分泌产生的 DNA片段，是循环游离 DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)的 一部分1。ctDNA含有与其来源月中瘤DNA同样的基因缺陷，如点突变，重排， 扩增等2;其在血液中的半衰期短，可实时反映月中瘤的动态变化3;作为液体活检 的一种，可克服组织活检中由于肿瘤异质性带来的缺陷，检测更全面4,因此ctDNA的检测可用于癌症早期诊断与癌症分期、月中瘤的疗效评估、复发监测和预 后判断等。由ctDNA的质量和数量变化大，因此需要高特异性和高灵
2、敏度的检 测方法。目前常用的方法有数字PCR (digital PCR, dPCR)、BEAMing (bead,emulsion,amplification and magnetic)高通量测序(next generation sequencing, NGS) ARMS等叫1.数字PCR1999 年 Vogelstein 等提出了数字 PCR(digtal PCR,dPCR)B概念7。数字 PCR 包 括两部分，即PCR扩增和荧光信号分析。先将是样品稀释后分配到大量微小的 反应单元中，每个单元包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子，然后分别对目标分子进行扩增，扩增结束后对每个反应单元的荧光信号
3、进行采集。数字PCR采 用直接计数的方法进行定量分析，有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝 的目标分子，记为1,无荧光信号的则即为0,理论上，在样品中极限稀释的情 况下，有荧光信号的反应单元数目等于目标 DNA分子的拷贝数。但是有的反应 单元中可能包含两个或两个以上的目标分子，这时需要用泊松概率分布公式进行计算网。不同于传统的qPCR技术，数字PCR不受扩增曲线的循环阈值(Ct)和扩 增效率的影响，无需参照，准确性和重复性好，可实现绝对定量分析9。根据反应单元类型不同，数字PCR分为三类：微反应室/孔板数字PCR、微流 控芯片和微滴数字PCR系统。微反应室/孔板数字PCR借助高通量自动上样设
4、 备和增加的反应单元数，实现快速精确取样，提高检测灵敏度。微流控芯片技术是 一种基于含有数千个超高密度亲疏水微孔芯片的dPCR平台，可实现高通量、低成本分析。微滴数字PCR( droplet digital PCR ,ddPCR)是将含有目标分子的样品 分成成千上万个纳升级的油包水微滴，再对每个微滴进行扩增，和荧光信号的采 集，更容易实现小体积和高通量10。数字PCR可绝对定量，是目前灵敏度最高的检测技术，但其也存在一定缺点， 如生成的微滴必须服从泊松分布，所以不适合高浓度DNA样本检测，；只能检测 已知的突变且一次只能检测一种突变11,12。技术BEAMing技术在检测ctDNA内体月中瘤突
5、变具有非常高的灵敏度，它是结合了 数字PCR以及流式技术的一种检测方法，最早是由BertWgelstein提出。其方法 是每一类DNA分子都会专一的与磁性珠相连接，然后 DNA分子之间的差异可 以通过流式细胞仪检测荧光标记来做出评估。这种方法是基于小珠（Bead）、乳浊液（Emulsion）、扩增（Amplfication）、磁性（Magnetic）,这四个主要组分来构建的， 所以被称作为BEAMing 13。BEAMing技术的过程包括：首先是分离和纯化血浆中的 DNA ;接着是预扩增 步骤，通过使用常规PCR扩增目的基因片段，使用引物与已知的标记序列混合； 然后，这些DNA模板再通过乳液P
6、CR扩增，应用引物探测这些序列，通过链 酶亲和素磁珠相互作用与有磁性的微胶珠结合。通过这种方式设计的系统，在反应结束之前，每个乳液液滴中生成的 PCR产物将保持对微胶珠的附着性，使其 可以很容易地通过磁性进行分离和纯化14。并且，BEAMing技术是利用磁珠来 吸附游离DNA,它可以从1万个健康细胞DNA中检测出那一个ctDNA分子， 具有较高的敏感性，同时在很多研究中其在月中瘤组织中发现的突变都和ctDNA部分突变是一致的1516。BEAMing技术相比其他检测技术具有很多优势：（一）在常规实验室条件下， 数以万计的DNA分子可以通过该种方法来进行评估。（二）特异的突变可以通过 流式细胞仪进
7、行分离筛选以备进一步分析和研究。（三）BEAMing技术可以用来 对特定组织或者人群中罕见的突变，以及研究一般基因序列或转录的产物的变异 都可以提供相应的鉴别和定量分析。由于外周血流中ctDNA拷贝的数量是很低的，特别是相较于野生型 DNA来说。出于这个原因，使用 PCR进行DNA扩 增是BEAMing过程中的一个重要部分，是确保可靠检测的保证 5。然而，BEAMing这项检测技术只能检测已知突变， 且成本较高17同时，它的 操作也较复杂，通量低，且单分子扩增在非均一的微滴中实现，需要 RCR预扩 增，会增加试验误差1203.基于NGS技术的检测方法ctDNA检测技术，除了基于PCR检测方法之
8、外，还有一种以高通量测序技术， 又称下一代”测序技术（NGS）为基础的检测方法。这种方法主要是选定十几到 几十个月中瘤相关基因进行测序，测序通量和效率高。根据富集策略的不同，基于NGS的技术目前又可分为靶向扩增子测序（TAS）及 目标序列捕获测序（TCS）o靶向扩增子测序（TAS）技术是针对目的基因设计几十对甚至上百对PCR引物，利用多重PCR扩增富集。代表性方法有标记扩增深度测序（TAM-Seq）。Forshew 等18通过TAM-Seq测序技术，检测患者癌细胞中 ctDNA片段，从而找到月中瘤 样品中的遗传突变。这种方法无需外科手术或者活检，就可以找到癌症突变。目标序列捕获测序（TCS）技
9、术是针对目的基因设计探针，通过捕获杂交的方法 富集，代表性方法有深度测序月中瘤个体化建档法（CAPP-Seq）。Newman等19从 月中瘤基因突变数据库找复发突变相关的外显子，再从月中瘤基因图谱库的407位非小细胞肺癌患者全基因组测序结果筛选。 然后应用迭代算法使每个非小细胞肺癌 患者样本的错义突变最大化来简化筛选器（selector）的大小，最后的selector能识 别139个复发突变基因中的521个外显子和12个内含子，长度约为125kb，平 均能够识别4个单核甘酸突变（SNV）,在96%的肺腺癌或鳞癌患者身上有效。基于NGS技术的检测方法灵敏度高，能同时检测多个基因的多种变异。但是
10、其技术复杂，数据处理困难，实验室水平差异较大，仪器与试剂的成本相对较高。 想要临床应用，首先要将其标准化120技术ARMS ,全称为突变扩增系统（Amplification refractory mutation system）,是由 Newton等人首先建立并用于检测基因已知突变的方法20。利用PCR弓I物3端碱 基必须与其模板DNA互补才能进行有效扩增的基本原理，根据已知突变位点设 计引物，使3末端碱基分别与突变和野生型模板碱基进行互补，实现扩增，达到将突变”模板与 野生”模板区分的目的12。ARMS法的主要特点有高特异性，高灵敏度以及耗时短，成本低，操作简单等特点。其检测结果的高特异性关
11、键在于引物设计。 ARMS法所用的引物是通过筛选能够识别单个位点等位基因的引物，进而保证了结果的高特异性。而ARMS法 检测点突变的检出率还取决于 PCR反应条件的优化和防止引物与靶 DNA错配 可能发生的错配延伸。PCR反应条件的优化可以通过改变引物浓度、靶 DNA浓 度、Taq酶浓度以及反应体系温度进行调整21。止匕外，在反应体系中加入甲酰胺 可以减少非特异性扩增，在引物 3末端引入第二个错配碱基也可以提高引物的 特异性21。通过在体系中加入多对引物可以实现多重扩增，实现基因的多位点突变检测22 0ARMS法检测灵敏度明显高于直接测序法等其他方法，可检测出样品中含量 低至%的突变基因；且该
12、方法结合 PCR技术，操作简单，耗时短，成本低， 结果直观23。目前，ARMS法已成为国际上月中瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，具在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。但该方法只能用于检测已知突变，在一定程度上限制其应用。ARMS法检测可以分为实时荧光定量 PCR和巢式ARMS法电泳检测。实时荧 光定量PCR是指ARMS技术结合探针对扩增产物进行检测，在实时定量PCR平 台上实现对样品DNA中稀有突变的检测24。而巢式ARMS法电泳检测是利用 凝胶电泳技术检测扩增带，从而实现结果分析25 o随着ARMS技术的发展，商品化的ARMS试剂盒相继问世，包括人表皮生长 因子受体（EGFR）
13、基因突变检测试剂盒，人KARS基因突变检测试剂盒，四项 耳聋基因检测试剂盒等130总结作为重要的月中瘤分子标志物，ctDNA在月中瘤的诊断、治疗监测、预后等方面发 挥着重要的作用，而 DNA测序技术的发展使得通过检测 ctDNA来指导月中瘤的 临床进展变得更加切实可行。数字PCR技术、BEAMing技术、NGS技术、ARMS 技术在ctDNA的检测中各具其独特的优势和不足之处，实际应用时应结合具体 条件决定采用何种检测方法。相信随着技术的进步，ctDNA将会逐渐从科研领域向临床转化发展。参考文献1 Yong E. Cancer biomarkers: Written in blood. Nat
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