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1、.原理BCA蛋白浓度测定试剂盒（BCA Protein Assay Kit是根据目前世界上最常用蛋白浓度检测方法之一 BCA法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。检测浓度下限达到 25微克/毫升，最小检测蛋白量达到 0.5微克，待测样品体积 为120微升。二. 试剂盒组份 组 份Cat: KGPBCA （250 assay酶标板/50assay 1mL比色杯） 蛋白标 准溶液（0. 5 卩 g/ 0L 5 mL BCA试齐U A 25 mLX 2 BC弑齐U B 1mL三. 操作步骤A.酶标板操作1.标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂 孔号0 1 2
2、3 4 5 6 7蛋白标准溶液（uD 0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水（20 19 18 16 12 8 4 0 对应蛋白含量（yg 0 0.51.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0孔号01234567蛋白质溶液（yD01248121620.J、一乙 厶 IAI J水（yD2019181612840相应蛋 白质含 量（yg00.512468102. 根据样品数量，按 50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B （ 50:1 ）配制适量BCA工 作液，充分混匀；3. 各孔加入200卩L BC工作液;4. 把酶标板放在振荡器上振荡30sec, 37C放置30分钟，然后在562
3、nm下比色测定。以蛋白含量（卩0为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；5. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20 yD加入BCA工作液200 yD充分混匀，37C放置30分钟后，以标准曲线 0号管做参比，在 562nm波长下比色，记录吸 光值；6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（yg,除以样品稀释液总体积（20 yD,乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单 位：y g/ ULB.分光光度计测定1. 标准曲线的绘制：各管按照下表加入试剂孔号0 1 2 3 4 5 6 7蛋白标准溶液（y L 05 10 20 40 60 80 100 去离子水（y L 10
4、0 95 90 80 60 40 20 0 对应蛋白含量（yg 0 2.5 5.010.0 20.0 30.0 40.0 50.02. 根据样品数量, 作液,充分混匀;按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B （50:1 ）配制适量BCA工3. 各管加入1000卩L BC工作液;4. 各管充分混匀，37C放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量（卩0 为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线;5. 稀释待测样品至合适浓度，样品稀释液总体积为100 uL加入BCA工作液1000 uL充分混匀，37C放置30分钟后，以标准曲线 0号管做参比，在 562nm波长下比色，记录 吸光值;6.
5、 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（ug,除以样品稀释液总体积（100uLL,乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单 位：ug/ u）四 . 注意事项1. 配制好的混合 BCA工作液室温24小时内稳定。2. 加入BCA工作液后，也可以在室温放置 2小时，或60C放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时,吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低,适合在较高温度孵育,或延长孵育时间。3待测样品浓度在 502000微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。4. BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达 5%的 SDS, 5%的 Triton X-100, 5%的 Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA二硫苏糖醇低于 1mM , 3巯基乙醇低于1mM.不适 用BCA法时建议使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。5. 操作时要带手套。五、储存BCA试剂A和BCA试剂B室温保存，蛋白标准液 -20C冻存。