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1、谷丙转氨酶活性检测,1,血清谷丙转氨酶活性的测定,一、实验目的1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。,谷丙转氨酶活性检测,2,二、基本原理,血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与-酮戊二酸反应生成谷氨酸和丙酮酸：,谷丙转氨酶活性检测,3,生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。
2、据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。,谷丙转氨酶活性检测,4,谷丙转氨酶活性检测,5,* 仪器1. 515cm试管、刻度吸量管。2. 恒温水浴、离心机、721型分光光度计。* 试剂1.0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液0.1mol/L磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO414.22g或Na2HPO42H2O17.8g溶 解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml,4保存。0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：称KH2PO413.61g溶解dH2O中，稀释至1000ml, 4保存。将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80m
3、l混和即 为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4保存。,三、仪器与试剂,谷丙转氨酶活性检测,6,2. 标准丙酮酸（含丙酮酸2.0mol/mL） 取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为50mL。此液须当日用当日配。3. ALT底物液(含-酮戊二酸2mol/ml及DL-丙氨酸200mol/ml) 取-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸7g ,用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol /L NaOH调pH至7.4（因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。4. 2.4二硝基苯肼溶液 取分析纯2,4二硝
4、基苯肼19.8mg，用1mol /L HCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。5. 0.4mol/L NaOH溶液 常规配制。,谷丙转氨酶活性检测,7,1、血清样品制备 取鸡血100mL于4oC静置10hr，后经离心分离得到血清， 保存于冰箱中待用(由于血细胞中转氨酶活性较血清中 高，故应防止溶血；若血清中此酶活性过高，则可适 当稀释后再用) 。2、标准曲线制作 取6支干燥洁净的试管，按下表操作，得出实验结果。 以吸光度值为纵坐标，酶活力单位数为横坐标，在坐标 纸上绘制标准曲线。,四、实验操作,谷丙转氨酶活性检测,8,谷丙转氨酶活性检测,9,3、血清样品谷丙转氨酶活性的测定 取4支干燥洁净试管，
5、按下表操作（血清和底物溶液 事先保温10min）：,谷丙转氨酶活性检测,10,五、实验结果,1、将得出的吸光值在标准曲线上查得酶活性2、计算： 丙酮酸物质的量（mol） SGPT活性单位/100mL= 1000 时间（min）,谷丙转氨酶活性检测,11,1. 在测定SGPT时，应事先将底物、血清在37水浴中 保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。2. 标准曲线上数值在20500U是准确可靠的，超过 500U时，需将样品稀释。3. 转氨酶只能作用于L氨基酸，对D氨基酸无 作用。实验室多用DL氨基酸（较L氨基酸 价廉），若用L氨基酸，则用量减半。4. 溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高，
6、 会影响测定效果。5. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。,六、注意事项,谷丙转氨酶活性检测,12,6.丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封后易 变质为多聚丙酮酸，而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不 易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液。7.每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有 超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本 可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管,谷丙转氨酶活性检测,13,* 1个卡门氏单位的定义是：在温度25，pH7.4，波长340nm，光径1cm 的条件下，1ml血清使NAD
7、H的吸光度下降0.001的转氨酶活性。* 国际单位：在最适温度（25）下，1分钟产生1mol丙酮酸的酶量为1个活性单位，即1IU=1umol/min。* King法单位定义是：每1ml血清在37条件下与底物作用60 min，生 成1mol丙酮酸称为一个单位。 * Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37条件下与底物作用 30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。,七、酶活性单位的定义,谷丙转氨酶活性检测,14,六、临床意义,谷丙转氨酶活性检测,15,（1）肝胆疾病：急性病毒性肝炎，ALT是最为敏感的指标之一，会出现明显升高。慢性肝炎血清ALT升高一般不超过参考值的3倍，而且有时可降至正常。慢性活动性肝炎血清ALT可升高至参考值的35倍以上。活动型进行性肝硬化时ALT可中轻度升高，但在代偿期可正常或稍增高。患原发性肝癌时，ALT可正常或中轻度升高。胆道疾病如胆石症引起梗阻时，虽无肝细胞病变，但ALT可稍升高。 （2）其他疾病：心肌梗塞及心功能不全导致肝淤血可使ALT明显升高。骨骼疾病、多发性肌炎、肌营养不良均可使ALT活性升高。某些药物或毒物如异菸肼、鲁米娜、四氯化碳等可引起ALT活性升高。 参考值: 速率法：030IU/L,谷丙转氨酶活性检测,16,【思考题】 1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？ 2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要避免溶血？,