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1、蛋白质的显色反应实验二蛋白质的显色反应一、实验目的1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接 形式。2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 二、呈色反应1、双缩胭反应(1)原理：尿素加热至1801左右,生成双缩胭并放出一分 子氨。双缩胭在碱性条件下能与C心结合生成紫红 色化合物，此反应称为双缩腺反应。蛋白质分子中 有肽键，其结构与双缩服相似，也能发生此反应(二 肽和氨基酸都不能发生双缩服反应)。可用于蛋白质 的定性或定量测定。反应式如下:180。NH2NH2双缩服紫红色化合物双缩胭反应不仅为含有两个以上肽键的物 质所有，含有一个肽键和一个-CS-
2、NHz, -CH2-NH2, -CHR-NH2, -CH2-NH2-CH-NH2-CH2-OH 或-CH0HCH2NH2 等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。 岫3也干扰此反应，因为NH3与C心可生成暗蓝色的 络离子Cu (NH3) 42+o因此，一切蛋白质或二肽以上 的多肽都有双缩胭反应，但有双缩胭反应的物质不 一定都是蛋白质或多肽。(2)试剂尿素，10%氢氧化钠溶液，1%硫酸铜溶液, 跳卵清蛋白落液(改为蛋清溶液：水二1： 9)(3)操作取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热 使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热, 尿素放出氨，形成双缩服。冷后，加10%氢氧化钠 溶液约1
3、mL,振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴, 再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫蛔，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。（由于杂质以及氨气的干扰，导致颜色不都是紫红 色）向另一试管加2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液: 水=1： 9）约1mL和10%氢氧化钠溶液约2mL,摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫 瑰色的出现。2、黄三酮反应（1）原理蛋白质、多肽和各种氨基酸以及所有a-氨基酸均 能发生该反应，除无a-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸 呈黄色反应外，其它均生成蓝紫色化合物，最终生 成蓝色化合物。氨、B -丙氨酸和许多一级氨化合物都有此反应。尿素、马尿酸、二酮毗嗪和肽键上 0的亚氨
4、基不呈现四乒随 因此，虽然蛋白质或氨基 酸均有黄三 戴庭）屈雄与黄兰南反应呈阳性反应 的不一定都是蛋白质或氨基酸。或反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化脱氨形成酮酸，酮酸脱竣成 意，放出co2 nh3,水合黄三酮被还原成还原型苗三酮；第二步是所形成的还原型苗三酮同另一个水 合黄三酮分子和氨缩合生成有蓝色物质。反应机理如下：Nt% + C020/蓝紫该反应非常灵敏，1： 150万浓度的氨基酸水溶液即能给出反应,是一种常用的氨基酸定量测定方法。但在定性、定量测定中，一方面要严防干扰物存在, 另一方面要在适宜的PH条件下进行测定。该反应 的适宜的PH为57,同一浓度的蛋白质或氨基酸 在不同pH条件下的
5、颜色深浅不同，酸度过大时甚 至不显色。(2)试剂蛋白质溶液：雪解清蛋白戴新鲜鸡蛋清溶液(蛋清:水=1： 9),0.5%甘氨酸,0.1%苛三酮 水溶液，01%黄三酮-乙醇溶液。(3)操作沸水浴中加热12分钟，观察颜色由粉色变 紫色再变蓝色(pH不同颜色深浅不同)。在一小块滤纸上滴一滴0. 5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0. 1%黄三酮-乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。3、黄色反应 (1)原理含有苯环的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸 后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝酸酸钠。反应式如下 NaOH一-H0=O取N o Na*II硝基酚（黄色）
6、0邻硝褪酸剂（橙黄色）多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以呈黄 色反应，苯丙氨酸不易硝化，须加入少量浓硫酸才 有黄色反应。（2）试剂鸡蛋清溶液（将新鲜鸡蛋清用6层纱布过滤, 然后按鸡蛋清：水=1： 20配制而成。大豆提取液：将大豆浸泡充分吸胀后研磨成05%苯浆状再用纱布过滤。头发。指甲。 酚溶液。浓硝酸。0.3%色氨酸溶液。氨酸溶液。10%氢氧化钠溶液。（3）操作向7个试管中分别按下表加入试剂,观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加 热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化（14管可能需要加热）。号材料鸡蛋 清溶 液大豆 提取 液指 甲头 发
7、0. 5%苯酚0. 3%色 氨酸0. 3%酪 氨酸浓 硝VW4滴4滴少 许少许4滴4滴4滴现象1现象24、考马斯亮蓝反应(1)原理考马斯亮蓝G250 (R250)具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色;当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时 内稳定。在0.01l.Omg蛋白质范围内，蛋白质 浓度与A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质 含量。(2)试剂蛋白质溶液(鸡蛋清：水=1： 20配制而成)。 考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝G250100mg溶于 50mL95%乙醇中，加100mL85%磷酸混匀，配成原液。 临用前取原液15mL,加蒸镭水至100mL,用粗滤纸 过滤后，最终浓度为001%。(3)操作取两支试管，按下表操作试剂蛋白质溶 液(mL)1020.1蒸储水 (mL)考马斯亮 蓝染液 (mL)150.95结果分析：要分析结果，为什么出现这样的结果, 什么原因导致的？实验报告不能用铅笔写。