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1、实时荧光定量RT-PCR检测人外周血单个核细胞中F0XP3 mRNA的表达蒋卫平，丁茂文，朱亚非，李冰，朱晚林，李欣华，林菲菲【摘要】目的：成立实时荧光定量逆转录-多聚酶链反映 (real-time fluorescence quantitative RT-PCR)检测人外周血单个 核细胞中F0XP3 mRNA的方式，并研究其与CD4+CD25+Treg细胞活性相 关性。方式：提取人外周血单个核细胞总RNA,将mRNA逆转录成cDNA, 以P -actin为内参照，实时荧光定量RT-PCR检测29例哮喘患儿及24 例同龄对照F0XP3 mRNA的相对表达量，采纳融解曲线和琼脂糖电泳鉴 定PCR
2、产物特异性；同时采纳流式细胞技术检测CD4+CD25+Treg细胞 含量，分析二者相关性。结果：哮喘患儿组CD4+CD25+Treg细胞百分 率明显低于同龄对照组，P; F0XP3 mRNA的表达也显著降低，P； FOXP3和B-actin的融解曲线分析说明均仅有单一峰,Tm值别离为 和；琼脂糖电泳显示都仅有单一扩增产物。结论：应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR技术检测FOXP3 mRXA表达水平简便易行、结 果稳固靠得住。初步结果证明，外周血CD4+CD25+Treg细胞数量和 FOXP3 mRA表达有相同的趋势，存在必然的相关性。【关键词】 实时荧光定量RT-PCR；哮喘
3、；F0XP3； CD4+CD25+调剂性T细胞Abstract: Objective: To establish a real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) to detect FOXP3 mRNA expression in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and to investigate the correlations between activity of CD4+CD25+
4、 regulatory T cells and expression of F0XP3 mRNA. Methods: Total RNA was extracted with Trizol from human PBMCs and mRXA was transcribed reversely into cDNA. Real-time fluorescent quantitative RT-PCR with P -actin as the internal control gene was used to detect the expression levels of F0XP3 mRNA in
5、 29 pediatric patients with asthma and 24 age-matched healthy children. The specificity of PCR productions was identified with the dissociation curves and agarose gel electrophoresis. Flow cytometry analysis was used to assess the percentage of CD4+CD25+regu1atory T cells. The correlation between th
6、e expression and activity was analyzed. Results: The percentages of CD4+CD25+ regulatory T cells in group of asthma were significantly lower than those in group of control (P <, so did the expressions of FOXP3 mRNA (P <. The analysis of dissociation curves on F0XP3 and P -actin showed that bot
7、h of them had only one simple spike and the Tm values were C and ,respectively. The agarose gel electrophoresis of them showed only single PCR product each. Conclusion: It isan easy and reliable test to detect the expression level of F0XP3 mRXA by SYBR Green I real-time fluorescence quantitative RT-
8、PCR and the preliminary experimental result shows that the percentages of CD4+CD25+ regulatory T cells and the expressions of F0XP3 mRNA have the same trend and confirms the correlation between them.Key words: real-time fluorescence quantitative RT-PCR； asthma ； forkhead/winged helix transcription f
9、actor ； CD4+CD25+regulatory T cellsCD4+CD25+调剂性T细胞(Treg)是具有免疫抑制功能的一群 T细胞，在维持机体免疫自稳、免疫耐受和避免自身免疫性疾病的发 生方面具有十分重要的作用，叉状头/翅膀状螺旋转录因子(forkhead/winged helix transcription factor , F0XP3 )特异地高表达于 CD4+CD25+Treg,介导CD4+CD25+Treg在胸腺的发育、外周的表达及功 能的维持，可反映CD4+CD25+Treg活性水平支气管哮喘(以下 简称哮喘)是淋巴细胞、嗜酸性粒细胞(eosinophils, EOS)
10、和肥大 细胞等多种炎性细胞、炎症介质和细胞因子参与的气道慢性炎症性疾 病，其发病进程与效应性CD4+T细胞尤其是H型辅助性T细胞(Th2) 活化并分泌多种细胞因子紧密相关；CD4+CD25+Treg可能通过其免疫 抑制功能抑制Th2细胞的活化而阻止哮喘的发生和进展4。本实验成 立了 SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测人外周血单个核细胞中 F0XP3 mRNA的表达，并验证了其与流式细胞术检测CD4+CD25+Treg表 达的相关性，现报导如下。1材料和方式材料标本来源：2020年2月至5月在我院小儿科就医的29例哮 喘患儿(病程28年)及24例正常对照共计53例，年龄314岁
11、, 平均(62)岁，其中男32例，女21例，患儿诊断均符合中华医学 会儿科学会呼吸组制定的哮喘诊断标准5,正常同龄对照组均为无过 敏性疾病史的健康儿童；别离采取两管EDTA抗凝的静脉血2 mL,及 时送检。要紧仪器：BDFACSCalibur流式细胞仪，罗氏LightCycler 荧光PCR仪，电泳分析系统及凝胶成像系统。试剂：多甲藻素叶绿素蛋白(PerCP)标记的CD45单克隆抗 体(McAb)、人异硫氟酸荧光(FITC)标记的CD4McAb、藻红蛋白(PE) 标记的CD25McAb均购自美国BD PharMingen公司；淋巴细胞分离液 购自上海华精生物高科技；总RNA提取试剂盒Trizo
12、l、第一链cDNA 合成试剂盒、热启动荧光定量PCR核心试剂盒（SYBRGreenl染料法） 均购自上海闪晶分子生物科技；引物序列由上海闪晶分子生物科技合 成纯化。方式流式细胞仪检测外周血单个核细胞（PBMCs）中 CD4+CD25+Treg 的比例：别离加入 6 HL PerCP 标记的 CD45McAb、10 U L FITC 标记的 CD4 McAb 和 PE 标记的 CD25 McAb 于 50 口 L 的 EDTA 抗凝血中，避光孵育15 min,加入溶血素，避光溶血10分钟,用磷 酸盐缓冲液（PBS）洗涤1次，1 200 r/min离心5 min,弃上清，再 用500 HL PBS
13、重悬细胞，上流式细胞仪（BD公司）检测，结果用 CellQuest软件处置。引物设计：依照GeneBank提供的F0XP3 mRNA序列 （GeneBank 号：AF277993）和 8 -actin 序列（GeneBank 号：AY399813） 设计引物。目的基因F0XP3引物：上游（5 to3） F： CTGACCAAGGCT TCATCTGTG,下游（5 to3） R： ACTCTGGGMTGTGC TGTTTC,扩增片段 长度为176 bp,内参基因B-actin引物：上游（5 to3 ） F： TGACGTGGACATCC GCAAAG,下游（5 to3）R： CTGGAAGGTG
14、GACA GCGAGG, 扩增片段长度为205 bp0淋巴细胞分离：取2 mL的EDTA抗凝血加2 mL淋巴细胞分离液，倒置混匀,然后在2 000 r/min离心20 min。总RNA提取：警惕吸取上述分离的中间层白细胞（单个核 细胞）放入mL离心管（RNase-Free）中，然后加入1mL Trizol,倒 置混匀后，室温放置5 min,使其充割裂解，最后放入-80 冰箱保 留备用。将所有冰箱里的标本掏出室温解冻后，12 000 r/min离心 5 min,弃沉淀。加入200 UL氯仿（4 预冷），倒置混匀后室温放 置15 min, 4 C 12 000 r/min离心15 min。吸取上层
15、水相至另一 离心管（RNase-Free）中，加入mL异丙醇（20 预冷）倒置混匀 数次，室温放置510 min, 4 12 000 r/min离心10 min,弃上 清，RNA沉于管底。加入75%乙醇（-20 预冷），温和振荡离心管, 悬浮沉淀，4 8 000 r/min离心5 min,尽可能弃上清。室温晾 干或真空干燥510 min,最后加入50 UL DEPC处置的H20,适当混 匀，稍事离心备用。逆转录：取上述RXA提取物8 n L加入1 u L Oligo （dT） 18primer,警惕混匀，65 c 保温 5min,室温放置 10 min, 室温高速离心5 s,将所有溶液搜集到管
16、底。顺顺序别离加入以下 试剂：2XFirst-Strand Buffer 10 U L, RT-mix luL,整体积为 20 uLo警惕混匀稍事离心，42 50 min,然后90 处置5 min,冰上冷却，室温高速离心5 s,将所有溶液搜集到管底，-20 保留备用。荧光定量PCR反映体系：Hot start Fluo-PCR mix： 10 UL,上游引物(50pmol/uL)： UL,下游引物(50 pmol/U L)： uL,无菌去离子水：uL,上述逆转录后的cDNA： 2uL； 一个反 映体系的整体积为20 11 L。扩增条件设置 93 预变性2 min；93 变性15 s, 60 退
17、火20 s, 72 延伸30 s, 40个循环，每一个循环延伸后搜 集一次荧光，分析模式设定为定量分析；93 变性15 sec, 72 延伸1 min,最后设定温度93 ,温度转变速度为/sec,持续监 测荧光，进行熔解曲线分析。仪器检测通道选择F1通道。扩增产物电泳分析:将扩增后的毛细反映管警惕开盖倒扣 在mL的离心管中，4 000 r/min离心20 s,将产物全数搜集到离心 管中。配1%琼脂糖凝胶，制成电泳胶板(分子克隆实验指南)，取5 UL扩增产物加1 UL loading buffer混匀后上样，在100 V的电压 下电泳20 min,最后在凝胶成像系统中拍照成像。结果计算：用相对定
18、量的研究方式分析实验结果。F0XP3/B -actin 比值采纳 2 ZiCt 方式计算，Ct=Ctl-Ct2。统计学处置方式：经方差齐性查验后，采纳t查验比较两组 间不同，用简单直线相关分析探讨两因素之间相关性。2结果荧光定量方式学评判特异性F0XP3和B -actin扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 可见约176 bp和205 bp特异性条带显现，与理论上的目的片段长度 完全一致，同时进行熔解曲线分析，判定FOXP3和B-actin均只有一 尖峰，解链温度（Tm值）别离为和,说明别离仅有一扩增产物 （见图1-3）。线性范围与最低检测限定量浓度用Ct值的负对数表 示，将逆转录产物cDNA进行1
19、0倍倍比稀释，最低检测限为反映，线 性范围为反映，相当于Ct值从18到37的跨度，相关系数为。周 密度：取2份浓度高低不同（Ct值为21和35）的标本重复测定4次, 测定结果经对数处置后其批内CV值为,批间CV值为。哮喘患儿CD4+CD25+Treg明显下降29例哮喘患儿与24例正常儿童CD4+CD25+Treg检测结果别 离为（土）和（土）,不同有显著性（P）0哮喘患儿FOXP3 mRA改变29例哮喘患儿与24例正常儿童F0XP3/ B -actin的2-ACt 值别离为土和土，二者不同也有显著性（POoF0XP3 mRNA 与 CD4+CD25+Treg 二者相关性分析F0XP3 mRA在
20、外周血单个核细胞中的表达与CD4+CD25+Treg 在淋巴细胞中的比例呈必然的正相关（r =, P,见图4）。3讨论随着免疫学及分子生物学研究的深切，愈来愈多的证听说明 免疫功能紊乱在儿童支气管哮喘发病机制中起着重要作用，尤其是淋 巴细胞亚群的比例和功能紊乱更是当前关注的热点。众所周知，免疫 耐受的破坏和Thl/Th2功能失调是哮喘发病的重要环节。目前以为 CD4+CD25+Treg是机体免疫系统维持外周耐受的重要调控者，维持其 正常的水平和功能将有助于免疫系统对自身抗原的刺激成立良好的耐 受状态，从而可抑制哮喘的发生6。F0XP3作为一特殊的转录因子特 异地高表达于CD4+CD25+Tre
21、g上，与其发育和功能成熟紧密相关 7-8。咱们通过流式细胞仪和实时荧光定量RT-PCR检测发觉，哮喘 患儿外周血CD4+CD25+Treg的比例及F0XP3 mRNA的表达低于同年龄的 正常对照组，说明哮喘患儿由于CD4+CD25+Treg数量不足，免疫抑制 功能下降，致使效应性CD4+T细胞尤其是Th2细胞大量活化，产生大 量致炎因子致使哮喘发作或持续；能够假想，这种患者通过医治或自 然减缓后，CD4+CD25+Treg数量和F0XP3mRXA的表达升高，接近于正 常水平，发挥其免疫抑制功能，抑制Th2细胞活化，纠正Thl/Th2失 衡,增进哮喘减缓，提示CD4+CD25+Treg参与了哮喘
22、的发生和进展。SYBR Green I实时定量PCR与一般PCR相较，具有灵敏、快 速、特异的特点。因无需合成特异探针，利用方便；但同时非特异产 物可干扰靶基因的产物定量。SYBR Green I是一种荧光染料，能非特 异性地结合到双链DXA中去，一旦结合到双链DXA中后即能够发出荧 光，结合状态的荧光强度较游离状态强百余倍，因此能够依照荧光信 号强度定量检测双链DXA数量。可是SYBR Green I与双链DXA结合缺 乏特异性，在PCR反映中非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光， 可能会发生假阳性。为了幸免这种不利因素，本研究在定量反映终止 后进行融解曲线分析，以区分由PCR产物和本底造成
23、的荧光信号。分 析PCR产物的融解曲线能够证明扩增产物的特异性，特异PCR产物在 融解曲线上是单一峰，其Tm值较非目的产物高9。咱们发觉，F0XP3 和B-actin的融解曲线均仅有单一峰，Tm值别离为和也;琼脂糖 电泳进一步证明了其扩增特异性。本文初步结果证明，外周血CD4+CD25+Treg细胞数量和F0XP3 mRXA表达有相同的趋势，存在必然的相关性。咱们成立了一种从外周 血单个核细胞中检测F0XP3mRA的方式，其方式简单，重复性好，并有很高的灵敏性和特异性。【参考文献】一1Fontenot JD,Gavin MA, Rudensky programs thedevelopment
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