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1、切应力对PLGA膜片上内皮细胞形态及功能的阻碍熊猛，夏文森，鲁开化，艾玉峰，田晋洪，郭树忠【关键词】血管内皮细胞Effect of shear stress on the form and function of vascular endothelial cells on PLGA meshAbstract AIM: To study the growth of vascular endothelial cells (ECs) on PLGA mesh under shear stress in vascular bioreactor. METHODS: After seeded on PLG
2、A mesh, vascular ECs were given shear stress in vascular bioreactor for 7 d and the growth and the externalization of the cells were observed. RESULTS: After cultured for 57 d, the vascular ECs grew well and they elongated in appearance. The cells had a tendency to change their appearances along the
3、 orientation of the fluid. The ECs secretary volume was X 10-9 mol/min. CONCLUSION: The materials of PLGA have a good affinity to the cells. The ECs function of releasing NO and other active substances of blood vessels is normal. Primary experimental data tissueengineering vessel construction in vit
4、ro by using bioreactors and on the improvement of intima tolerance to blood flows impact.have been obtained for further researchesontheKeywords shear stress; vessel endothelial cells; bioreactors【摘要】目的：探讨血管生物反映器中切应力作用下血管内 皮细胞(ECs)在PLGA膜片的生长情形.方式：接种血管ECs于可降解 基质膜片PLGA上，施加不同切应力，观看细胞生长情形及分泌情形. 结果：在培育57
5、d后，ECs生长良好，形态略有伸长，细胞整体上 有沿流体方向改变形态的趋势.ECs在PLGA膜片上NO的分泌量为(土) X10-9 mol/min.结论：PLGA材料对细胞亲和力较好.ECs释放NO 等血管活性物质功能正常.为进一步开展采纳生物反映器体外构筑组 织工程血管及探讨提高组织工程血管内膜层抗血流冲击能力提供实验 数据.【关键词】切应力；血管内皮细胞；生物反映器0引言血管的内腔面被覆一层内皮细胞(ECs), ECs具有多种功能, 它不仅维持血管壁的形态及内表面的滑腻，还可调剂血管的通透性及 分泌多种生物活性物质（如PGI2, ET等），在组织工程中将ECs接种 于可降解材料的表面，形成
6、一层类似于体内血管管腔的内皮屏障结构, 避免移植物植入体内后的血栓形成及钙化.在以往的研究中，人工血 管内皮化后临床成效较差的要紧缘故确实是由于血流长时刻冲击致使 ECs的脱落而形成血栓.本实验中，咱们采纳自行研制的血管生物反 映器，在切应力的作用下，对牛血管ECs在聚羟基乙酸/聚乳酸（PLGA） 膜片材料上的生长情形进行了初步的研究，为进一步开展采纳生物反 映器体外构筑组织工程血管及探讨提高组织工程血管内膜层抗血流冲 击能力提供初步的实验数据.1材料和方式材料I型胶原酶为Invitrogen公司产品，RPMI 1640培育液及 DMEM培育液为Gibco公司产品，血管生物反映器为自行研制，N
7、O测定 试剂盒由第全军医大野战外科研究所提供.方式取新鲜屠宰的牛主动脉长约10 cm, g/L无菌生理盐水反复 冲洗管腔内外，去除附壁的血细胞，剪除外膜脂肪与筋膜，结扎小分 支血管，钳夹闭合主动脉管腔一端，从另一端注入g/L I型胶原酶， 至稍充盈，夹闭端口后置入37孵箱中孵育20 min （中间翻转一次）, 将液体搜集入10 mL离心管中，8001000 r/min离心57 min, 弃 去上清，加入1 mL 100 mL/L RPMI 1640培育液，反复吹打，形成细 胞悬液，倒置显微镜下行细胞计数，测浓度3X108/L,将细胞悬液移 入25 mL培育瓶中，24 h后换液，细胞贴壁生长后4
8、5 d传代，稳 固传代备用.切应力的计算依照切应力公式t =6 H Q/Wh2 1.其中 n为循环液的黏度，Q为循环液的流量，W为流室的宽度，h为流室的 高度.在本实验中，H = mPaS, W=6 cm, h= cm,因此切应力t与流量 Q 的关系为 t =（单位：dyn/cm2, Q： mL/min）.实验系统的组成整个实验系统采纳咱们自行研制的血管生物 反映器进行,系统由流动小室、恒流泵、医用硅胶管道、储液瓶组成.灌 流液由恒流泵泵出后经管道流入流动小室，对ECs施加剪切应力，再 经管道回到储液瓶中.整套系统置于37c恒温的C02培育箱中.灌流 液利用DMEM培育液.切应力的作用将37代
9、牛血管ECs以X 105/L个细胞的浓度 种植于一样大小的PLGA膜片材料上（采纳一样大小的盖玻片作为对 照），体外培育7 d后，将PLGA材料与盖玻片一起置于生物反映器的 灌流小室中，通过恒流泵给予ECs不同大小的切应力作用，依照国内 外文献2的报导，咱们采纳1, 2, 5和10 dyn/cm2 4种切应力别 离作用于第1, 3, 5, 7日.每日在倒置显微镜下观看膜片及盖玻片上 细胞的形态.的测定在第7日，搜集1 min内的灌流液标本，采纳N0测定 试剂盒，依照试剂盒的说明进行测定，观看流体切应力作用下ECNO 的表达.统计学处置:数据用x土 s表示,统计分析方式为t查验.2结果ECs种入
10、玻片及PLGA膜片上，都可在倒置显微镜下观看，细 胞34 h即开始贴壁、伸展，初始状态多为圆形，伸展后呈短梭形, 核呈圆形或长圆形，有一到数个核仁，可见核割裂像.细胞开始呈集 落生长，生长较快，5 d后各个细胞集落开始相互融合，细胞呈多角 形，融合成片后呈现特点性的鹅卵石样形态，排列致密，胞质丰硕.一 样57 d传代，经多次传代（超过8代后）或冻存苏醒后，细胞形态 会有所改变，可呈长梭形或多角形（FiglA）.在培育57 d后，可 慢慢发觉材料及盖玻片上的ECs形态伸长，细胞间隙略有增加，部份 区域细胞长轴顺流体的方向而排列，细胞整体上有沿流体方向改变形 态的趋势（Fig 1B,C） . 7
11、d后在10 dyn/cm2流体切应力的作用下， 测得内皮细胞在PLGA膜片上N0的分泌量为（土）X10-9 mol/min （n=6）,在盖玻片上的分泌量为（土）X 10-9 mol/min （n=6）.两片 上的分泌量不同有统计学意义（P<）.3讨论有关流体作用下ECs的转变的研究较多3,4,但比较体外 ECs在传统的培育介质（玻璃）与生物可降解材料PLGA膜片的研究还 未见报导.咱们发觉,不仅静息状态下ECs在PLGA膜片上生长状态良 好，在流场切应力较长时刻作用下也未见明显的细胞变圆及脱落的情 形（与盖玻片上表现相近），说明PLGA材料的细胞亲和力较好.ECs释放NO等血管活性物质
12、是流体力学转变调剂血管张力的 重要途径之一.一样以测定N0的代谢产物N02来间接反映0的含量. 实验中采纳N0检测试剂盒,初步测定了 ECs在PLGA膜片上NO的表达 情形，与在盖玻片上比较，二者无统计学不同，说明在PLGA上生长的 ECs不仅与材料较好地结合，且具有必然的分泌功能.从另一个侧面 反映了 PLGA材料的生物相容性.在流场的较长时刻的作用下，可增进 ECs的定向排布，有与流场方向相一致的排列散布趋势，以往研究说 明，人工血管（PTFE等）种植ECs尽管能够在短时刻内提高血管的通 常率，存在的要紧问题是种植的ECs在血流冲击下大多脱落5.因 此，血管移植物在体内就面临着内膜层可否耐
13、受血流的冲击.在体内 环境中，ECs 一方面依托机体对血流调剂的爱惜机制，另一方面依托 自身对流体环境产生适应性转变.ECs与基质的牢固结合依托细胞内 微丝形成的应力纤维(stress fiber).在非流动的环境下形成的 ECs,其微丝要紧以散布在细胞周围的致密周围束的形式显现，细胞中 间没有粗大的微丝束，只有少量短的微丝随意散布；而体外给予较小 的剪切应力，ECs即便没有形态的转变，细胞的中央也显现应力纤维, 说明剪切应力有诱导ECs形成应力纤维的作用.因此，在流体环境中，对种植的ECs慢慢进行剪切应力适应 性的“训练”，可促使中央应力纤维的形成，从而有利于内膜层对抗剪 切应力的作用.人体
14、血管所受的生理状态剪切应力大约为536 dyn/cm2.在本实验中，咱们慢慢增加剪切应力从110 dyn/cm2 (剪 切应力数值界于毛细血管与中小动脉之间)，慢慢给予ECs剪切应力的 “锻炼”，提高其抗血流冲击的能力.下一步工作中，咱们将具体探讨 适合的剪切应力训练量.因为过大可使ECs来不及形成应力纤维就己 经脱落，而过小那么诱导的应力纤维少，难以达到抗击体内较大剪切 应力的目的.咱们还观看到流体环境中ECs在P L G A或盖玻片上的增殖 均慢于静态培育中，这与其他文献报导结果一致.流动产生的剪切应 力对ECs的割裂具有抑制的作用.可能是一个相对处于静止状态的单 层ECs有助于其正常功能
15、的发挥.咱们采纳自行研制的血管生物反映 器，在剪切应力的作用下，对血管ECs在聚羟基PLGA膜片材料上的生 长情形进行了初步的研究，通过为期7 d的运行，整个反映器工作正 常，无污染，加液、取样方便，大体上达到了设计的要求，也为进一 步开展采纳生物反映器体外构筑组织工程血管及探讨提高组织工程血 管内膜层抗血流冲击能力提供初步的实验数据.【参考文献】1丛兴中，姜宗来，李玉泉.用于内皮细胞和滑腻肌细 胞联合培育的流动腔系统J.医用生物力学，2001； 16 (1)： 1-5.Cong XZ, Jiang ZL, Li YQ. A new flow chamber system for endoth
16、elial and smooth muscle cells coculture model j . J Med Biomech, 2001； 16 (1 )： 15.2韩林，张宝仁，柳兆荣，等.稳态层流下的内皮细胞形 态特点转变J.第二军医大学学报，1999;20(10)： 801-804.Han L, Zhang BR, Liu ZR, et al. Changes in the morphometric feature of endothelial cells under steady flow state j . Acad J Sec Mil Med Univ, 1999;20(10)：
17、 801-804.3薛军辉，张作明.流体切应力作用血管内皮系统机制的 研究J.第四军医大学学报，2001;22(增刊):97-100.Xue JH, Zhang ZM. The study on mechanisms of the effects of fluid shear stress on endothelial cells J . J Fourth Mil Med Univ, 2001;22(Suppl)： 97-100.4张文胜，陈槐卿.内皮细胞应力反映元件的研究进展 J.生物医学工程学,2001; 18(3) :461-465.Zhang WS, Chen HQ. The study on the shear stress responsive element in endothelial cells j . J Biomed Eng, 2001;18(3):461-465.5 Sayers SD, Rapt is S, Berce M. Longterm results of femorotibial bypass with vein or polytetrafluoroethylene see comments j . Br J Surg, 1999;86(1):137.