EMSA原理流程.docx

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1、凝胶迁移或电泳迁移率实验EMSA可以：1研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；2可用于DNA定性和定量分析；3用于研究RNA结合蛋白和特定 的 R N A 序 列 的 相 互 作 用.实验方法原理凝胶迁移或电泳迁移率实验EMSA-electrophoretic mobility shift assay是一种研究 DNA 结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析.这一技术 最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究 RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互 作用.通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和 32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变 性的聚丙

2、烯凝胶电泳上,别离复合物和非结合的探针. DNA-复合物或RNA-复合物比非结 合的探针移动得慢.同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链.当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,局部纯化蛋白,或核细胞 抽提液.在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或局部纯化 的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液.竞争实验中采用含蛋白结合序列的 DNA或RNA片 段和寡核甘酸片段特异,和其它非相关的片段非特异,来确定DNA或RNA结合 蛋白的特异性.在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特 异结合.试剂、试剂盒t-32PATPT4

3、多聚核甘酸激酶Nuclease-Free WaterT4多聚核甘酸激酶缓冲液醋酸俊 TE无水乙醇TBEbuffer重蒸水甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺甘油过硫酸俊TEMEB甲基乙二胺EMSA Gel-Shift结合缓冲液澳酚蓝仪器、耗材水浴锅PCRK离心机电泳仪电泳槽实验步骤一、探针的标记1.如下设置探针标记的反响体系:(D(2)(3)(4)(5)(6)待标记探针pmol/微升：2微升.T4 Polynucleotide Kinase Buffer 10X : 1 微升.Nuclease-Free Water： 5 微升.-32PATP3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml : 1 微升

4、.T4 Polynucleotide Kinase 5-10 u微升：1 微升.总体积10微升根据上述反响体系依次参加各种试剂,参加同位素后,Vortex混匀,再参加T4Polynucleotide Kinase,混匀.2 .使用水浴或PCR仪,37c反响10分钟.4.再参加89微升TE,混匀 率在30%以上,即总放射性的3 .参加1微升探针标记终止液,混匀,终止探针标记反响.此时可以取少量探针用于检测标记的效率.通常标记的效30%以上标 记到了探针上.为实验简便起见,通常不必测 定探针的标记效率.最长使用时间一般不宜超过 3天.标记好的探针可以保存5 .标记好的探针最好立即使用,在-20 C

5、 0二、探针的纯化通常为实验简便起见,可以不必纯化标记好的探针.在有些时候,纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果.如需纯化,可以根据如 下步骤操作：1 .对于100微升标记好的探针,参加1/4体积即25微升的5 M醋酸俊,再参加2体积即 200微升的无水乙醇,混匀.2 .在-70C至-80C沉淀1小时,或在-20C沉淀过夜.3 .在4C, 12 000 g-16 000 g离心30分钟.小心去除上清,切不可触及沉.4 .在4C, 12 000 g-16 000 g离心1分钟.小心吸去剩余液体.微晾干沉淀,但不宜过分 枯燥.5 .参加100微升TE,完全溶解沉淀.标记好的探针最好立即使用,最长使

6、用时间一般不 宜超过3天.标记好的探针可以保存在 -20C.三、EMSA胶的配制1 .准备好倒胶的模具.可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具,或其它适当的模具.最 好选择可以灌制较薄胶的模具,以便于干胶等后续操作.为得到更好的结果,可以选择可 灌制较大EMSA胶的模具.2 .根据如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis 对结果影响不大).(1) TBE buffer (10X): 1 毫升.重蒸水毫升.(2) 39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2 毫升.(3) 80% 甘油：625微升.(4) 10%

7、过硫酸俊(ammonium persulfate): 150微升.(5) TEMED : 10 微升3.根据上述次序参加各个溶液,参加 TEMED前先混匀,参加TEMED后立即混匀,并马 上参加到制胶的模具中.防止产生气泡,并加上梳齿.如果发现非常容易形成气泡,可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理.四、EMSA结合反响1 .如下设置EMSA结合反响阴性对照反响：(1) Nuclease-Free Water : 7 微升.(2) EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) : 2 微升.(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子：0微升.(4)标记好的探针：1微升.(5)总体积：10微升.样品反响

8、：(1) Nuclease-Free Water： 5 微升.(2) EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) : 2 微升.(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升.(4)标记好白探针：1微升.(5)总体积：10微升.探针冷竞争反响：(1) Nuclease-Free Water： 4 微升.(2) EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) : 2 微升.(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升.(4)未标记白探针：1微升.(5)标记好白探针：1微升.(6)总体积：10微升.突变探针的冷竞争反响：(1) Nuclease-Free Water ： 4 微升.(2) EMSA/

9、Gel-Shift 结合缓冲液(5X) : 2 微升.(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升.(4)未标记的突变探针：1微升.(5)标记好白探针：1微升.(6)体积：10微升Super-shift 反响：(3) Nuclease-Free Water 4 微升.(4) EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) : 2 微升.(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升.(4)目的蛋白特异抗体：1微升.(5)标记好白探针：1微升.(6)总体积：10微升.2 .根据上述顺序依次参加各种试剂,在参加标记好的探针前先混匀,并且室温(20-25 C )放置10分钟,从而消除可能发生的探针和蛋白的

10、非特异性结合,或者让冷探针优先反响.然后参加标记好的探针,混匀,室温(20-25C)放置20分钟.3 .参加1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色,10X),混匀后立即上样.注意：有些时 候澳酚蓝会影响蛋白和 DNA的结合,建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液. 如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样,可以在无色上样缓冲液里面添加 极少量的蓝色的上样缓冲液,至能观察到蓝颜色即可.五、电泳分析1 .用作为电泳液.根据10V/厘米的电压预电泳10分钟.预电泳的时候如果有空余的上样 孔,可以参加少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色),以观察电压是否正

11、常进行.2 .把混合了上样缓冲液的样品参加到上样孔内. 在多余的某个上样孔内参加10微升稀释 好白1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色),用于观察电泳进行的情况.3 .根据10 V/厘米的电压电泳.保证胶的温度不超过 30C,如果温度升高,需要适当降 低电压.电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料澳酚蓝至胶的下缘 1/4处,停 止电泳.4 .剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比拟厚实的滤纸. 小心取下夹有EMSA胶的 胶板,用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液.小心翻开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板),把滤纸从EMSA胶的一

12、侧逐渐覆盖住整个 EMSA胶,轻轻把滤纸和胶压紧.滤纸被胶微微浸湿后(大约缺乏1分钟),轻轻揭起滤纸, 这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来.把滤纸侧向下,放平,在 EMSA胶的上面覆盖一层 保鲜膜,保证保鲜膜和胶之间没有气泡.5 .干胶仪器上枯燥EMSA胶.然后用X光片压片检测,或用其它适当仪器设备检测. 其他一、常见问答1. ?什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序 列相互作用的技术,可用于定性和定量分析.这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用.通常将纯化的蛋白和细胞

13、粗提液和 32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变 性的聚丙烯凝胶电泳上,别离复合物和非结合的探针. DNA复合物或RNA复合物比非结 合的探针移动得慢.同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链.当检测如转录调控因子一类的 DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,局部纯化蛋白,或核细胞 抽提液.在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或局部纯化 的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液.竞争实验中采用含蛋白结合序列的 DNA或RNA片 段和寡核甘酸片段特异,和其它非相关的片段非特异,来确定 DNA或RNA结合 蛋白的特异性.在竞争的特异和非特异片段的存在下,依

14、据复合物的特点和强度来确定特 异结合.2. ?实验中需要用到什么试剂凝胶迁移实验需要的结合蛋白,可来源于纯化或局部纯化的蛋白,或粗的核和胞质抽提液. 还必须制备同位素标记的 DNA或RNA.一般,DNA核甘酸探针用32P和T4多核甘酸激 酶来作末端标记,同位素标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核甘酸在体外 合成.Promega公司的Riboprobe/sup系统a,b可用于同位素标记的 RNA的体外合成, DNA 5末端标记系统,用于制备DNA探针,结合反响所需的组分有：含盐的溶液氯化 镁,氯化钠,或氯化钾、缓冲体系Tris-HCl或HEPES、复原剂DTT、甘油、非 特异的竞争D

15、NA poly dI:dC dI:dC,也可能含非离子去污剂.在结合蛋白和同位素 标记的探针作用后,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,别离复合物,随后将凝胶枯燥并放射 自显影,或用 PhosphorImage/su盼析.3. ?凝胶迁移实验系统提供了什么试剂Promega公司提供一种凝胶迁移实验系统检测 DNA结合蛋白,系统可作为这类实验的一种 阳性对照.系统包括目的寡核甘酸,对照 DNA结合蛋白,结合缓冲液,用于寡核甘酸探 针末端标记所需的试剂.Core系统包括含重组AP2蛋白AP2抽提液的大肠杆菌抽提 液和AP2的同源寡核甘酸.AP2抽提液是从表达AP2蛋白的大肠杆菌中提取的.另外, Core系

16、统还含SP1同源寡核甘酸,凝胶迁移结合缓冲液,和能作20次对照实验的HeLa核抽提液.Complete系统含另外5个双链寡核甘酸,分别是AP1、OCT1、CREB、NF-kB、 TFIID结合位点的同源序列.这些寡核甘酸可以在末端标记后用作特异性探针,或在竞争 实验中用作非特异性探针.4. ?成功进行凝胶迁移实验,需要优化哪些因素凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速,但要成功地进行凝胶迁移实验,需要优化一些参 数,这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响.以下是需要优化的因素：抽提 液的制备核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解,结合蛋白的浓度,探针的浓度,非特异 性探针的浓度,缓冲液的配方和pH

17、,聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件,保温时间和温度, 载体蛋白,是否有辅助因子比方锌,或镉等金属离子,或激素.总之,反响总体积应 最小20 口 .为满足一般要求,结合缓冲液含 4%甘油,1mM MgCl2 , EDTA , DTT, 50mM NaCl, 10mM Tris-HCl , ml poly dI:dC ,或 10mM HEPES , 50mM KCl , 1mM DTT , 1mM EDTA , 10%甘油,ml poly dI:dC可作为优化实验的起始.5. ?在DNA探针的选择上,要考虑哪些重要因素目的DNA的长度应小于300bp,以有利于非结合探针和蛋白DNA复合物的电泳别离.

18、双 链的合成的寡核甘酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针.如目的蛋白已被鉴 定,那么应用短的寡核甘酸片段约为 25bp,这样结合位点可和其他因子的结合位点区别 开.长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位. 随后 可用DNaseI印迹对蛋白结合的特异区域在 DNA序列水平上作出分析.6. ?用以下一些转录调节因子和 HeLa细胞核抽提物可形成哪些复合物： AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB.当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白的来源时,每1个转录调节因子和它相关的DNA同 源序列结合形成特征型的结合形

19、态.以下的文字描述了每一个单独的转录调节因子,包括识别的同源序列,因子的大小,特定的结合条件,以及和HeLa细胞核抽提物可形成的复合物的数目.1 .细胞核蛋白提取: 取约x 106个HSC-T6细胞,5ml PBS/Phosphatase Inhobitors 冲洗,收集细胞.参加 ml 1 x Hypotonic buffer重悬,冰浴15min；参加256NP-40 ,震荡10s； 14000x g离心,30s, 4C;收集上清即胞浆蛋白,于- 70c 保存.将沉淀重悬于 50 g l Lysis buffer (含DTT和Protease Inhibitor Cocktail )中,震荡

20、10s；置于摇床中冰浴 30min, 150次/min ;再次震荡30s, 14000Xg离心,10min, 4C;取上清即为核蛋白,于-70c保存,测定蛋白质浓度. ?2.寡核甘酸探针的标记和纯化：rat : NF-kB: 5 AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC 3取寡核昔酸探针双链各 56,稀释为1006 (终浓度10PM ; 97c加热15min,室温冷却,37c孵育45min.配制如 下反响体系：10 x buffer 2 g lmM dNTP(无 d ATP) 3 g l寡核昔酸DNA 1 ii la-32PdATP 4 g l ddH2O g lKlenow Fragme

21、nt g l (6U)37c孵育60min.将标记的探针参加用 STE预湿润的Sephodex-25 DNA纯化柱,参加 TE 70 g l ,加压收集液体于 EP管 中.取16 测放射性比活度.?3.聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影： (1)配制8 %聚丙烯酰胺凝胶10XTBE 5ml30 %丙烯酰胺10 ml10 %过硫酸胺ml TEMED 0n lddH2O 35 ml电泳液为1XTBE(2)配制反响混合液：M TrisCl 1 g l1M NaCl 1 g l10 mM EDTA 1 g l10 mM DTT 1 g l20 mM MgCl2 1 g l2 ng/ g l Poly dldC 1 g l25 %甘油3 a la -32PdATP 1 gl (不低于 5 万 v Ci)取5 Vg核蛋白,参加反响混合液,ddH2O#足20从l总体积.冷探针：参加 16 20 PM未标记探针.Supershift :加入NF-kB p65抗体1“g,室温下孵育45min.8%聚丙烯酰胺凝胶预先电泳30min后上样,100V电泳约3h.小心取下胶,吸附在滤纸上,外表用保鲜膜覆盖.干胶仪干胶40min,暗盒中压3-4张胶片,- 70c冰箱中放射自显影 2-3天,冲洗胶片.