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1、DNA浓度和纯度的测定-分光光度法一、目的熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法.二、原理DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,具吸收峰在 260nm处.波长为260nm时,DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有 关,也随构型而有差异.对标准样品来说,浓度为 1 wg ml时,DNA钠盐的OD260= 0.02当OD260 =1时,dsDNA浓度约为50区g / mlssDNA浓度约为37区g / mlRNA浓度约为40区g / ml寡核甘酸浓度约为30区g /ml youyu底物不同有差异当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时,会影响 DNA吸光度 的
2、准确测定.一般情况下同时检测同一样品的 OD260、OD280和OD230,计算其比值来衡量样品的纯度.经验值：纯 DNA:OD260/OD28g 1.晚1.9,说明有RNA污染； 1.6,说明有蛋白质、酚等 污染纯RNA 1.7COD260/OD28OC2.0 1.7时说明有蛋白质或酚污染； 2.0 时说明可能有异硫富酸残存OD260/OD280的比值用于估计核酸的纯度,OD260/OD230估计去盐的程度. 对于 RNA纯制品,其 OD260/OD2802.0, OD260/OD230应大于 2.OD260/OD2802.0可能是蛋白污染所致,可以增加酚抽提；OD260/OD2302说明去
3、 盐不充分,可能是GIT污染所致,可以再次沉淀和70%乙醇洗涤.三、材料、试剂及器具1、材料提取的PUC19样品、PUC19标准样品2、试剂灭菌重蒸水,TE缓冲液3、器皿xx比色皿；UV-240紫外分光光度计四、操作步骤1、UV-240紫外分光光度计开机预热10min.2、用重蒸水洗涤比色皿,吸水纸吸干,参加 TE缓冲液后,放入样品室的S 池架上,关上盖板.3、设定狭缝后校零.4、将标准样品和待测样品适当稀释DNA5w 1 或RNA4w 1 用TE缓冲液稀释 至1000后,记录编号和稀释度.5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上,关闭盖板.6、设定紫外光波长,分别测定 230nm、260nm、280nm波长时的OD值.7、计算待测样品的浓度与纯度.DNA样品的浓度wg / 乩1OD260X稀释倍数XRNA样品的浓度区g / 以1OD260X稀释倍数X