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1、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA检测及临床意义一一间接荧光免疫(HF)方法(欧盟) aFC、I .至、ANCA概念及分类抗中性粒细胞胞浆抗体是一种以中性粒细胞和单核细胞胞浆成份为靶 抗原的自身抗体，对系统性血管炎炎症性肠病等多种疾病的诊断和鉴别诊断具有重要的意义，已成 为自身免疫性疾病的一项非常重要的常规检测项目o目前，已经有十余种中性粒细胞胞浆成分被证实为ANCA勺靶抗原，蛋白酶3(PR3),髓过氧化物酶(MPO,人白细胞弹性蛋白酶(HEL),乳铁蛋白(LF),组织蛋白酶G(Cath G),杀菌/通透性增强蛋白(BPI),人溶酶体相关膜蛋白2 (H-LAMP2),溶菌素 (LYS) ,天青杀素
2、女防御素，烯醇化酶，葡萄糖醛酸酶。根据乙醇固定勺中性粒细胞基质片中，可以区分两种不同勺荧光模型: 一种胞浆型(c-ANCA,是均匀分布在整个中性粒细胞胞浆中的颗粒型荧光，细胞核无荧光。在乙醇和甲醛固定勺中性粒细胞片中，其荧光模型表现相同。其主要的靶抗原 是蛋白酶3 (PR3) o另一种是核周型(p-ANCA,是围绕中性粒细胞细胞核周围的平滑带状荧 光.由多种抗原引起，主要靶抗原是髓过氧化物酶(MPO),人白细胞弹性蛋白酶(HEL),乳铁蛋白(LF),组织蛋白酶G(Cath G),杀菌/通透性增强蛋白(BPI),人溶酶体相关膜蛋白2 (H-LAMP2),溶菌素(LYS)等。不同抗体在乙醇和甲醛固
3、定的中性粒细胞片中，其荧光模型表现有所不同。抗MP酰体产生的p-ANCA因耐甲醛，其荧光模型与在乙醇固定的中性粒细胞中出现的c-ANCA类似故叫甲醛抗性的p-ANCA而其他非MPOS体不与甲醛固定的中性粒细胞反应，无荧光表现，这 种类型又称为甲醛敏感的P-ANCA故根据乙醇和甲醛固定的中性粒细胞片表现，可初步判定ANCA勺靶抗原PR3 MPO非MPC三类。二、ANCA勺检测至今也是最常用的经典间接荧光免疫方法是检测ANCA勺参考方法或者标准方法w方法q IIF是区分c-ANCA和p-ANCA勺基础，有较高敏感性，,可半定 量，但HF测定的是总ANCA不能准确区分靶抗原,需特异性的检测方法作 为
4、补充。 ，, 代丁， .由于多种免疫性疾病患者存在ANA用IIF法检测ANCA寸，会产生干扰实验 结果勺判 断。为避免干扰现象，采用了四基质联合勺检测即：乙醇固定勺粒 细胞；甲醛固定的粒 细胞；Hep-2 （人喉癌细胞）细胞;猴肝细胞。基质片各细胞分布及意义如表一所述。ANCA荧光模型及表现如表二所述,；表一：四联基质片分布及意义区:AN荧光模型c-ANCA阳性性分ANA的胞有典型| J十 扰: 甲醛荧光 耐受p-ANCA分ANA细胞和其胞。，日性ICA阳性胞出现荧时阳性,rANC中的肝甲醛只有 肝敏 感a prAN 所有肝 CA表二：ANCA荧光模型及表现、L r .V /乙醇固定粒细胞胞质
5、呈现弥细颗粒荧光质荧光清晰出核的轮廓页核之间荧强，Hep-2 细皇丽杨国的&现, 清 板丝犬散的f勾勒j,分光增Hep-2I质平荧光表现甲醛固定粒细胞Hep-2细胞猴肝细胞胞质呈现弥散的细颗粒荧光U胞质荧光清阴性醛抗出核的轮廓页核之间荧h分.判 i光增c-ANC肝细胞本身无荧光.仅肝血窦粒细胞生 p-ANCA 抗 MPO 出现荧光。方醛固定胞质呈现弥抗体耐 甲乙醇固;F醛，其荧光与在壬的中性粒细胞中要笔:A借助猴状或不规贝血窦粒呈现核干血窦滑丝状；， 令如果两 荧光日亥同者, 中 日性 的细胞： y 一儿田1胞质分页。的块1质猴肝分页状或不规则的块粒细胞细颗粒荧儿质荧光清晰出核的轮廓乙醇固定粒
6、细胞2:区p-ANC :,胞甲醛敏 i勾勒.还是耐3分:光增是标准卖区分两 种的C-甲醛敏 感MPO抗中性粒 细阴性表现匹验基质Q中荧光模型:阴性. 阴性ICA类似我p-ANCA其他非yl-H 英光华体不与甲醛固定的仅肝 血窦粒细胞:田胞反应，无荧光出 现荧光。c-ANCA p-ANCA肝脏细胞本身无-Hi. /J儿。仅肝血窦粒细胞出现荧光。状。细胞核呈肝细胞核阳性6细胞核阳性,荧现荧光表肝血窦粒细胞未ANCA阴性阴性光强度增强现，女口 ANA甲醛耐受P-ANCA阳性性甲醛敏感P-ANCA阳性性所述荧光表现如细胞核呈细胞核阳性，荧光强度增强细胞核阳性，荧光强度增强C-ANCA阳性，乙醇，甲醛固
7、定粒细胞所述阴性现荧光表现，女口 .Ai则所述。细胞核呈现荧光表现,女口 ANA所述。肝细胞和肝血窦粒细胞都有荧光。肝细胞和肝血窦粒细胞都有荧光。二、注意事项为提高对疾病诊断的特异性，检测时应注意以下问题1、检测ANCA一般建议同时做HF初筛和确认实验，以提高ANCA勺临床应用价值，不做单独初筛或单独确认实验，以免降低对疾病诊断的特异性。 引7 4仁 n 尸* 4* o. 7*F r b2、不能仅检测抗PR3和MPO两种特异性抗体，而不检测，这样容易限制ANCA对疾病诊断的特异性。3、用HF检测时，仅使用乙醇固定的粒细胞片，这样不能严格排除ANA的干扰，容易出现假阳性。四、临床意义（一）加。与
8、原发性小血管炎韦格纳肉芽肿CWG），显微多动脉炎（MPA）,坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN 和变应性肉芽肿性血管炎（CSS）等等原发性系统性小血管炎的发病与ANCA密切相关, 临床上已将上述疾病统称为ANCAW关小血管炎。ANCA特异 性PR3抗体和抗MPOS体的 检测已成为原发性小血管炎的敏感特异的血清学 检测项目1抗PR3抗体特异性PR3抗体为WG的标志性抗体，抗PR3抗体荧光模型以c-ANCA为 主。但以c-ANCA诊断WGt异性为90%,而以抗PR3抗体的特异性可超过95%。抗PR3抗体在其他*Fe*的原发性血管炎中业可以检测出来，但阳性率较低华抗PR3抗体敏感度与疾病的活动性及病
9、程有关，在疾病的早期症状不明显时，就可出现阳性。因而抗PR3抗体常作为WG勺早期诊断、疗效判断、复发估计的指标，对 临床治疗有重要的参考价值。2、抗MP （抗体抗MP0抗体荧光模型以p-ANCA为主，主要与MPA NCGNCSS相关。还 可见于其他 疾病，如节结性多动脉炎，抗肾小球基底膜肾病，WG, SLE, RA,药物诱导的狼疮，Felty综合症等。抗体滴度与疾病活动性相关，可用于早期 诊断、疗 效判断、复发估计的指标,对临床治疗有重要的参考价值。抗MP0抗体阳性高度提示坏死性血管炎或特发性NCGN对诊断原发性小血管炎的 特异性达到99%0因而每一个不明原因的血管炎或肾小球肾炎的患 者，都应
10、该检测 ANCAo表三：ANCA与原发性小血管炎相关疾病韦格纳肉芽肿（WG）荧光模型C, P （少见）靶抗原()PR3 (85), MP( 10)显微多动脉炎（MPA）a pPR3(45 MP (45)坏死性新月体性肾小球肾炎，（NCGN） a p （少见）PR3 (25), MP( 65)变应性肉芽肿性血管炎（CSS）C- P （少见）PR3( 10), MP( 60)结节性多动脉炎（PAN少见PR3(5), .MPO (15)抗肾小球基底膜病（抗GBNPMPO（二）ANCA与药物诱导性血管炎近年来不断有药物治疗引起的ANCA阳性的病例报道,如丙基硫氧喀咤,肌苯哒嗪,普鲁卡因酰胺，青酶胺,美
11、满霉素，他巴唾/甲疏咪唾等Q其中报道比较 . 7 r / 7 q 多的是长期使用丙基硫氧喀咤引起的ANCA其特点是滴度高，抗体谱广（抗原主要是MPO也可同时伴有或单独出现其他靶抗原，如PR3LF, CathG, BPI, LYS 等)。药物诱导性血管炎患者临床表现与原发性血管炎类似，停止丙基硫氧噌咤用药后,临床症状好转，ANCA可转阴。因此，长期使用丙基硫氧嚏咤治疗 过程中,夕夕、应定期检测ANCA及早发现药物诱导性血管炎。（三）ANCA与其他疾病除原发性血管炎外，其他一些疾病中也可出现ANCA主要为P-ANCA其靶抗原并非PR MP。而是LR Cath G, BPL LYS等1、慢性炎症性肠
12、病（CIBD）CIBD是一种消化系统的自身免疫性疾病，包括溃疡性结肠炎（ UQ,克内窥镜及组织学诊断,罗恩病（CD两种。以往的CIBD诊断依赖X线检查,缺乏有效的试验室指标。近年来研究发现UC病人血清中ANCA阳性率为60-80%,而CD患者的阳性率为10-20%,多为p-ANCA相关靶抗原有BPI等。滴度与疾病的活动度和病程无关。因为p-ANCA在UC阳性率高，CD阳性 率低，故可作为两 者的鉴别诊断及UC早期诊断指标。2.结缔组织病在结缔组织病中，ANCA阳性主要见于SLE和RA其他结缔组织病中少 见。但文献 一 报道在SLE和RA阳性率差异特别大(16-69%)，这可能与使用方 法，抗原基质片及工 作人员水平有很大关系。SLE中ANCA阳性可能与慢性炎症反应有关，如动脉炎，浆膜炎和CRP增 加等。有报道抗MP航体与RA的关节外损害及血管损害有关。3、自身免疫性肝病在自身免疫性肝病中，也可检测到P-ANCA在原发性硬化性胆管炎(PSC)患者中，p-ANCA阳性率高达70-80%,是该病重要的血清学指标.4、其他疾病有文献报道，HIV,阿米巴，细菌感染以及不明原因的肺部慢性炎症及纤维化患者中有p-ANCA?日性。