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1、微生物限度检查的方法验证一、细菌、霉菌、酵母菌方法学验证1、样品：云芝肝泰颗粒规格：2g/袋批号：200610012、培养基：霉菌液体培养基；营养肉汤培养基；营养琼脂培养基；0.1%蛋白胨溶液；虎红钠琼脂培养基；由中检所培养基室提供。3、方法：中国药典2005年版微生物限度检查法方法学验证。4、验证试验用菌种：验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌（26003）、大肠埃希菌（44102）、白色念珠菌（98001）、枯草芽孢杆菌（63501）、黑曲霉菌（98003），菌种来自中国医学细菌保藏中心。5、菌液制备：取经32培养1824小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml加入9
2、ml0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至细菌数约为50100CFU/ml备用。取经25培养1824小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml，加入9ml0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至细菌数约为50100CFU/ml备用。取经25培养一周的黑曲霉菌斜面培养物，加0.9%氯化钠溶液3ml，洗下孢子，吸出菌液（用管口带有薄的无菌棉花的无菌毛细吸管）至无菌试管，取1ml加入9ml0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至约为50100CFU/ml备用。6、供试液制备：取样品适量，至无菌研钵中，研细，称取10g，加PH7.0、无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100ml，用研钵研匀，制成1：10均匀供试液。7、回收率测定：（1）
3、试验组取供试液1ml和50100CFU试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。（2）菌液组测定所加的试验菌。（3）供试品对照组取1ml供试液，按菌落计算方法测定供试品菌落数。8、实验结果:试验组试验次数金黄色葡锢球菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉菌大肠埃希菌12平均12平均12平均12平均12平均172707162616261606150495075737427172726061616062614951507270713707171606161626363474647717272菌液组平皿数金黄色葡锢球菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉菌大肠埃希菌
4、1766569557927764675376平均7765685478供试品对照组次数细菌霉菌、醉母菌12平均12平均100000020000003000000稀释剂对照组试验次数金黄色葡锢球菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉菌大肠埃希菌12平均12平均12平均12平均12平均172737363626364656550495075767627473746064626364645153527572743707171636063646364515252727373试验组回收率实验次数菌种名称验证加菌数(CFU)试验组样品本底数回收率()1金黄色葡锢球菌7771092.2枯草芽抱杆菌6562095.3白色
5、念珠菌6861089.7黑曲霉菌5450092.5大肠埃希菌7874094.82金黄色葡锢球菌7772093.5枯草芽抱杆菌6561093.8白色念珠菌6861083.7黑曲霉菌5450092.5大肠埃希菌7871091.03金黄色葡锢球菌7771092.2枯草芽抱杆菌6561093.8白色念珠菌6863092.6黑曲霉菌5447087.0大肠埃希菌7872092.3稀释剂对照组回收率实验次数菌种名称验证细菌数(CFU)稀释剂对照回收率()1金黄色葡锢球菌777394.8枯草芽抱杆菌656396.9白色念珠菌686595.5黑曲霉菌545092.5大肠埃希菌787697.42金黄色葡锢球菌77
6、7496.1枯草芽抱杆菌656295.3白色念珠菌686494.1黑曲霉菌545296.2大肠埃希菌787494.83金黄色葡锢球菌777192.2枯草芽抱杆菌656396.9白色念珠菌686494.1黑曲霉菌545296.2大肠埃希菌787393.5二、控制菌方法学验证1、验证样品：云芝肝泰颗粒批号：200610012、培养基：胆盐乳糖、MUG、靛基质；由中检所培养基室提供。3、方法：中国药典2005年版微生物限度检查法方法学验证4、验证试验用菌种：验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌（26003）、大肠埃希菌（44102）来自中国医学细菌保藏中心。5、菌液制备：取经32培养1824小时，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的肉汤培养物1ml加9ml氯化钠溶液，10倍稀释至每1ml含菌数10100CFU。6、供试液制备：取样品10g,加PH7.0、无菌氯化钠蛋白月东缓冲液100ml,用匀浆仪搅匀，制成1：10均匀供试液。7、实验结果：试验组检出大肠埃希菌，阴性对照组未检出大肠埃希菌。结果表明按常规法检查大肠埃希菌，方法可行。