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1、百度文库-让每个人平等地提升自我炭疽杆菌的快速鉴定王艺钧10生物技术3班 0326摘要杆菌(Bacillus anthraci )属于需氧杆菌属，能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽 病。炭疽杆菌曾被帝国主义作为致死战剂之一。平时，牧民、农民、皮毛和屠宰工作者易受 感染。皮肤炭疽在我国各地还有散在发生，不应放松警惕。我们利用炭疽杆菌的特性，通过微生物学检查，观察炭疽杆菌在含血平板上幼稚菌落待征、溶血和粘性，再进行高价效噬菌体快速裂解试验、青霉素纸片串珠试验和活性炭NaHC0平板CO贻养物的荚膜肿胀试验，可在短时间内完成对炭疽杆菌的定性鉴定，而不需要对其深入分子水平的检测。1 .立项依据与研究内容
2、1.1 项目的立项依据炭疽热是一种古老的人兽共患传染病。炭疽是由炭疽杆菌引起的人兽共患急性、热性、败血性传染病。其病理变化的特点是脾脏显著肿大，皮下及浆膜下结缔组织出血浸润，血液凝固不良，呈煤焦油样。人感染后多表现为皮肤炭疽、肺炭疽及肠炭疽，偶有伴发败血症。人类炭疽病是由于接触病畜的皮毛、吸入带病菌(芽抱型)尘埃，或进食未煮熟的病畜肉类而感染。该病潜伏期约7天，但彻底发病多达 60天，早期症状包括咳嗽，但很快会发展为严重的呼吸障碍和痉挛。由于炭疽病起初的症状类似流感，非常容易被人忽略。一旦发病，病人在几天内就会死亡。因此，快速检测出炭疽杆菌和有炭疽杆菌引起的症状的辨别对临床和治疗有着重大的意义
3、。如今，炭疽杆菌的鉴别技术已近很成熟，如：免疫学检验技术、核酸检验技术、适配子、肽核酸、生物传感器、生物芯片、化学分析技术、核酸测序与指纹图分析技术等等2。1.2 项目的研究内容/炭疽杆菌的特点革兰氏阳性细菌；长而直的大杆菌，菌体两端平直；大小为1. 5umX 35um,致病菌中最大的；无鞭毛，不能运动。在病人、病畜体内多散在或呈 23个短链排列，有荚膜(红 色)。炭疽杆菌为兼性需氧菌，在 1244c都能生长，最适生长温度为 37 Co最适pH为。在活炭疽病畜体或死亡后未经解剖的尸体内，不形成芽胞。一旦体内炭疽杆菌暴露于空气中，接触了游离氧，在一定温度下 (12-42 C)就会形成芽胞。芽胞呈
4、卵圆形或圆形，位于菌体中央或稍偏向一端。百度文库-让每个人平等地提升自我分离特性从临床患者和病畜标本中分离炭疽芽抱杆菌是比较简便的，但从环境样品中分离和鉴定芽胞则相对较困难，主要是缺乏有效的富集方法，环境样品中含有其它形成芽泡的需氧菌，它们的过度生长可干扰芽抱发芽或干扰检测。气溶胶释放后，对污染区人或动物的采样，采集鼻腔、面部、头发内的样品最为重要。芽抱的如下特性有利于芽抱从环境样品中的分离3:芽抱耐热：样品前处理时可以加热6365 C20 min杀死大部分繁殖体,并促进芽抱发芽,， 芽抱耐乙醇：样品前处理时 可以用50 %乙醇处理1 min杀死大部分繁殖体,因此从环境样品中分离芽抱并不受细菌
5、繁 殖体污染的干扰；芽抱的浮力较大：我们可以用蔗糖或双相甘油 -水分离芽抱。另外，芽抱 的疏水性使之与土壤颗粒结合紧密，给分离带来了困难，因此，分离芽泡时一般用非离子型去垢剂减少这种紧密结合，提高分离效率。分离后的炭疽杆菌接种到 LB培养基，注意无菌低温 4度保存，以备鉴定。培养特性炭疽杆菌幼稚菌落:(1)呈典型狮子头状，边缘不整齐，常有小尾突起,(2)均不溶血；(3) 菌落有粘性，用接种针挑取，拉丝现象明显。选择这样的典型菌落是顺利进行菌种鉴定的先决 条件。因此必须控制分离平板的孵育时间。血平板在37c中孵育1215小时即可，孵育时间愈长，炭疽杆菌在平板上的菌落特征愈不明显。在的中，于CO绅
6、境下，也能形成荚膜，形成是毒性特征，有毒株在平板，20%CO单养下，形成粘液状(有)，而无毒株则为粗糙状。在普通琼脂平皿培养基上生长成不透明、灰白色、扁平、表面粗糙的菌落，边缘不整齐，能形成几个或数十个菌体相连的长链，低倍显微镜观察呈卷发状。在血液琼脂平皿培养基上，生长出湿润粘稠的菌落，菌落周围不溶血。最终鉴定在大多数情况下，炭疽芽抱杆菌的鉴定是比较容易的。血琼脂培养基上的菌落形态具有很重要的鉴定意义，例如，表面无光泽、菌落扁平、白色或灰白色、不溶血及边缘呈卷发状等；如果加上其它一些培养特征，如无动力、青霉素敏感、噬菌体裂解、在含碳酸氢 钠的血琼脂培养基(5 % 20 %CO2比形成荚膜等，就
7、可以认为这一菌株是具有毒力的炭疽芽 抱杆菌，其余的生化测试意义不大。而通过PCR术扩增荚膜和毒素基因也可以达到鉴定的 目的1。对不典型荚膜可以用 McFadyeans s试验鉴别：将可疑菌落与数毫升血液混匀，37 C孵育4小时，然后做血涂片，热和酒精固定后，用亚甲蓝(Poly2chrome emthylene blue)百度文库-让每个人平等地提升自我染色，炭疽芽抱杆菌染成黑色，荚膜染成粉红色。虽然已发现一些炭疽芽抱杆菌的菌株不能产生荚膜，甚至还有人报道发现可产生荚膜而不产生毒素的炭疽菌株。事实上，如果一个菌株满足上面的鉴定指标，而只是荚膜或毒素阴性，仍然可以鉴定为炭疽芽抱杆菌。参考文献 /
8、Z1 Turnbull P C B. Definitive identification of Baci llus anthracis 2a2杨瑞馥，韩延平，宋亚军，杜宗敏，翟俊辉，甄蓿等.炭疽芽胞杆菌检测鉴定技术研究 进展J微生物学免疫学进展 2002年第30卷第2期:53-663 Hail S , Rossi CA ,Luding GV, et al . Comparison of noninvasive sampling sites for early detection of Bacil lus anthracis spores f rom rhesus monkeys after a
9、erosol exposure J. Mil Med 1999 ; 164(12) :8332837.1.3 研究方案研究思路提取样品一显微镜观察一血琼脂培养基鉴定、营养培养基鉴定、青霉素串珠实验、噬菌体裂解和青霉素敏感实验、碳酸氢钠平板鉴定。标本采集和样品处理我们以土壤标本为样品，在牲畜死亡或宰杀的地点，应取土壤标本以供检查。一般要采集表层土壤(10cm内)，取150g左右。 样品加热6365 C20 min杀死大部分繁殖体，并促进芽抱发芽； 样品用50 % 乙醇处理1 min杀死大部分繁殖体，因此从环境样品中分离芽抱并不受细菌繁殖体污染的 干；用蔗糖(用量不能太多)溶解；离心取上清液( 1
10、000rcf/min ),溶于LB培养基中， 培养至OD600nm值为，因为在这时候是菌体较多的时候，又不在衰老期，在 4c保存，备 用。显微镜检查步骤：涂片、革兰染色及荚膜染色、显微镜检查。取末稍血液制成涂片后，染色镜检，发现有多量单在、成对或24个菌体相连的短链排列、竹节状有荚膜的粗大杆菌，即可初步认为有炭疽杆菌。因为血液中应为无菌，所以如 在血液内有特征明显的菌，则可初步确定为炭疽杆菌。37c中孵育1215小时，观血琼脂培养基的鉴定取血琼脂平板、营养琼脂平板，制备好的菌液各涂布，在百度文库-让每个人平等地提升自我察培养情况。由上面的特性可知， 在营养琼脂平板中，/炭疽杆菌粗糙不发光，比较
11、扁平，有点儿象蜡 样杆菌的菌落但较小，卷发状，有的菌体形态不规则，有彗星状拖尾，白或灰白色；在血琼 脂平板中，生长出湿润粘稠的菌落，菌落周围不溶血。如果出现这种情况，即可更进一步判断为炭疽杆菌，否则，可以排除炭疽杆菌。结果参考：血平板营养平板如果出现如图所示的结果,可以确定为炭疽杆|菌。 如果实验结果出现溶血现象，或营酢青霉素串珠试验埔养基上菌落异常，则可能是别的菌，或是平板遭到了污染。用含有青霉素的小滤片纸（纸片蘸取每毫升含 50100u青霉素溶液或每片含 1个u青霉素的干燥纸片均可）,贴在涂有细菌的平板上，孵育46小时用显微镜直按观察。由于青霉素由纸片向外扩散，总有一圈合适浓度使炭疽杆菌形
12、成典型串珠，结果明显，观察方便。因为炭疽杆菌对青霉素敏感，低浓度的青霉素（单位/毫升）即可阻碍细胞壁的形成,不能保持正常的杆状外形。培养4-6小时可以看串珠实验结果。结果参考:如果在青霉素纸片的辐射范围内出现如图所示的串珠现象，则可以初步判 断为炭疽杆菌，如果没有出现菌落， 或是菌落形态异常，则可以排除为炭 疽杆菌。噬菌体裂解和青霉素敏感性将制备好的菌液密集划线接种于平板上,在划线区内一处滴一诊断用炭疽船体,另百度文库-让每个人平等地提升自我处贴一片青霉素纸片，纸片放下后，不能再动，37 c孵育824h后，观察结果。如果在滴噬菌体处有透明噬菌体斑，青霉素纸片周围有明显的抑菌环，便宜可断定接种物
13、为炭疽芽胞杆菌。噬菌体实验中因蜡样芽抱杆菌可能会有假阳性，但因其对青霉素不敏感，所以两者同时做可以排除蜡样芽抱杆菌。否则，结合以上几个实验，可以排除炭疽杆菌。结果参考：青霉素平板/碳酸氢钠平板碳浓度可用CO2培养箱增至2040%,使用极为方便。有毒力的炭疽杆菌于 37c孵育5小时即能生长荚膜。取5小时培养物加以公鸡制备的高效价抗炭疽荚膜血清，在玻片上作荚膜肿胀试验，出现荚膜特异反应者为有毒力的炭疽杆菌。因为炭疽杆菌的毒力、碳酸氢钠平板上生长的粘液状菌苔和炭疽杆菌白荚膜三者有平行关系，现将它们联合试验。活性炭NaHCO甲板CO绵养5小时后,荚膜肿胀试验阳性的炭疽杆菌说明存在炭疽荚膜抗原成份，结合
14、该菌在空气中培养生成粗糙的狮子头状菌落特点，可判断为炭疽毒株。故荚膜肿胀试验不仅可测定细菌荚膜的抗原性，在一定条件下，可作为一种体外毒力试验。如果长不出荚膜，则不是炭疽杆菌；如果出现粗糙状，则为无毒或毒性低的炭疽杆菌。1.4 可行性分析/由于炭疽杆菌的研究比较深入和透彻，如今的炭疽杆菌的检测方法已达十几种，免疫学检验技术、核酸检验技术、适配子、肽核酸、生物传感器、生物芯片、化学分析技术、核酸测序与指纹图分析技术等等，但是有很多技术在如今我们学校的实验室可能不具备设备和条件。所以对炭疽杆菌的检测， 我们根据炭疽杆菌的特性设计实验，依然能够鉴别出炭疽杆菌。对于准确的分子水平的 PC叱术检测炭疽杆菌
15、的 poxl和pox2两个基因，只用这种方法就可百度文库-让每个人平等地提升自我以检测，但是如今PCRT展要使用的引物由外面公司制备，从送出去序列到拿到引物， 在这段时间里，我们已经可以把我们上述的实验完成了，所以PCFa术测核酸不符合我们所要求的快速检测。在实验室中已近有了我们实验中所涉及的仪器和设备，试剂等。这是实验顺利进行得重要保障。2. 研究基础与工作条件2.1 工作基础实验课和课后在实验室做实验积累的实验经验和操作熟练程度，由于炭疽研究比较透彻，在培养过程中用到的培养基都已经有商品卖了，因此在实验的过程中比较方便快速，还有，这些实验鉴定方法前人已经阐述得很清楚，因此，对实验的起着很好
16、的指导和参考作用。2.2 工作条件仪器和设备二氧化碳培养箱，普通培养箱，恒温水浴锅，电子天平，普通光学显微镜，超净工作台， 冰箱，灭菌锅。材料血琼脂平板（BA）：取血液琼脂基础（商品） 克，加热溶解于100ml蒸储水中，121c 高压灭菌15分钟，冷至5055c时，无菌操作加入 5%10%（V/ V）预温至37c的无菌脱 纤维羊血，混匀，倾入无菌平皿。营养琼脂平板：蛋白脐 1g,牛肉膏，氯化钠，琼脂 2g,蒸储水100mL制法：将除琼脂以外的各成分溶解于蒸储水内，加入15%氢氧化钠溶液校正 pH至。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，121c高压灭菌15min,倒平板备用。/碳酸氢钠平板：称取碳酸氢钠琼脂基础（商品） ，加热溶解于88ml蒸储水中，121 C高 压灭菌15分钟，冷至50 C左右时，加入10%菌碳酸氢钠溶液 12ml ,充分摇匀，倾入无菌 平皿。炭疽噬菌体：购买成品商品青霉素敏感纸片：购买成品商品脱纤维羊血：购买成品商品试齐I蒸储水，50叱醇，蔗糖，LB培养基，青霉素。百度文库-让每个人平等地提升自我3. 其它要说明的问题实验中，要保持无杂菌的污染，因此要做好器皿和材料的灭菌。在晚上完成平板的涂布，在培养箱中过夜培养，第二天早上就可以观察到实验结果，因此，这个实验计较方便。在碳酸氢钠平板鉴定中，我们可以根据荚膜的情况， 可以鉴别出炭疽杆菌毒性的有无和强弱。