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1、2021/3/11,1,第三章 细胞破碎,2,2021/3/11,生物分离过程的一般流程,3,2021/3/11,不同类型的细胞分泌目标产物的类型,动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌在培养液中。植物细胞：多为胞内产物。微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外；大多数大分子产物和基因重组产物为胞内产物，如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等均为胞内产物。对于胞内产物，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。,4,2021/3/11,主要内容,3.1 细胞壁的组成与结构3.2 细胞破碎技术的分类3.3 常用破碎技术3.4 破碎技术的发展方向3.5 破碎率的测定,5,2021/3/11
2、,3.1 细胞壁的组成与结构,微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜。细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞免受机械损伤的功能；细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控制胞内外一些物质的交换渗透作用。 细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。,6,2021/3/11,细菌的细胞壁,几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固骨架肽聚糖组成。G+细胞壁结构与G-有很大不同。破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于肽聚糖上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。,7,2021/3/11,8,2021/3/11,酵母菌的细胞壁,主要成分：葡聚糖与甘露聚糖以
3、及蛋白质等，比革兰氏阳性菌稍厚，面包酵母的细胞壁厚度约为70 nm，而且其厚度随菌龄增加而增加。有可能仅有一部分厚度对酵母细胞壁的刚性和强度起重要作用。,9,2021/3/11,结构：最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，中间是一层糖蛋白，再外面是网状结构的甘露聚糖。破碎阻力主要决定于壁结构交联的紧密度和壁厚度,10,2021/3/11,其他真菌的细胞壁,大多数真菌的细胞壁主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成。真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它
4、还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。,11,2021/3/11,细胞壁的组成与结构,12,2021/3/11,细胞壁的结构和细胞破碎,破碎时必须克服的主要阻力是网状结构的共价键。细胞的大小和形状以及聚合物的交联程度都是影响破碎难易程度的重要因素。 壁结构不仅取决于遗传信息也取决于生长环境，真菌的壁结构还随发酵罐中混合的机械作用而变化。,13,2021/3/11,虽然通过改变遗传密码或环境因素能够改变细胞壁的结构，但还没有实验证明，该法能提高对机械破碎的敏感性，也不能够预测各种微生物对机械破碎的相对阻力。在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结构和组成显得特别重要，可用来作为选
5、择溶菌酶和化学方法的依据。,14,2021/3/11,15,2021/3/11,16,2021/3/11,化学破碎将细胞壁溶解与渗透压作用相结合，胞内外的渗透压差与胞内外低分子溶质的浓度差c成正比 = cRTR为常数,17,2021/3/11,3.2 细胞破碎技术的分类,18,2021/3/11,几种细胞破碎方式的比较,机械破碎通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。珠磨法、挤压法、匀浆法、超声法。物理破碎通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。温度差破碎法、压力差破碎法。,19,2021/3/11,化学破碎通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。有机溶剂、
6、表面活性剂、酸碱。酶促破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎。外加酶制剂法、自溶法,20,2021/3/11,影响破碎难易程度的重要因素,机械法细胞的大小和形状、细胞壁厚度、聚合物交联程度。显然，细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。（破碎细胞）非机械法细胞壁、膜的组成和结构。了解细胞壁的组成和结构，就可选择合适的溶菌酶和化学试剂，以及在使用多种酶或化学试剂相结合时确定其使用的顺序。 （溶解壁膜上的某些组成打洞）,21,2021/3/11,3.3 常用破碎技术,珠磨法(bead mill)实验常用高压匀浆法(High-pressur
7、e homogenization)-大规模细胞破碎的常用方法超声破碎（Ultrasonication）-主要用于实验室x-press法酶溶法研究较广的一种方法化学渗透法 其它方法,22,2021/3/11,珠磨法,bead mill实验常用工作原理：细胞悬浮液与极细的珠子(玻璃、石英砂、氧化铝等研磨剂，直径1mm)一起快速搅拌或研磨，研磨剂珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。,23,2021/3/11,实验室规模：Mickle高速组织捣碎机、Braun匀浆器；中试规模：胶质磨；工业规模：高速珠磨机(High-speed bead mill),24,2021/3/11,工业
8、规模：高速珠磨机。圆盘高速旋转，使细胞悬液和玻璃珠相互搅动，细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。,25,2021/3/11,典型的珠磨机的构造,瑞士：Dyno Mill。磨室具夹套，可冷却。在料液的出口处有一旋转的圆盘和出口平板（出口位于平板的中部）很靠近，可防止珠体随料液带出。,26,2021/3/11,西德生产的容量20L的LM-20型珠磨机,27,2021/3/11,28,2021/3/11,除磨室以夹套冷却外，搅拌轴和圆盘也可以冷却，圆盘交错地装在轴上，一种处于径向，另一种和轴倾斜，径向圆盘使磨料沿径向运动，而倾斜圆盘使产生铀内运动。这种交错的运动，提高了破碎效率。,29
9、,2021/3/11,细胞破碎率可用一级反应动力学表示：间歇操作： ln1/(1-R)=Kt连续操作： ln1/(1-R)=K其中=V/F,30,2021/3/11,操作条件的选择,珠体大小根据细胞大小、浓度以及连续操作时不使珠体带出来选择。珠体装量装量少时，细胞不易破碎；装量大时，能量消耗大，研磨室热扩散性能降低，引起温度升高。,31,2021/3/11,温度温度高时细胞较易破碎，但要考虑目的产物不受破坏。一般温度控制在540内时影响较小。搅拌转速过高将使能量消耗大增，而破碎率上升不明显。,32,2021/3/11,破碎率的控制：,破碎率高时，单位破碎细胞的能耗明显上升；高破碎率产生较多的热
10、能，增大了冷却控温的难度；破碎率越高，细胞碎片越小，分离碎片越困难；高破碎率下，目的产物的失活损失增加。 （珠磨法的破碎率一般控制在80%以下，并兼顾下游过程）,33,2021/3/11,高压匀浆法,(High-pressure homogenization)大规模细胞破碎的常用方法工作原理：细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。,34,2021/3/11,进口,出口,35,2021/3/11,破碎的动力学方程：,
11、式中：KT与温度等有关的破碎常数N悬浮液通过匀浆器的次数P操作压力a微生物种类常数,36,2021/3/11,破碎压力的选择：,增大压力和增加破碎次数都可以提高破碎率，但当压力增大到一定程度后对匀浆器的磨损较大，此外当压力超过一定值后，破碎率的增加很慢。在工业生产中，通常采用的压力为5570 MPa。,37,2021/3/11,破碎一般规律：（1）酵母较细菌难破碎；（2）处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的细胞难破碎；（3）在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培养基上培养的细胞较难破碎。,38,2021/3/11,不宜采用高压匀浆法破碎的有：（1）易造成堵塞的团状或丝状真菌，（2）较小的革兰
12、氏阳性菌，（3）某些质地坚硬的亚细胞如包含体（inclusion body）。,39,2021/3/11,大、中、小型高压匀浆器,40,2021/3/11,超声破碎,（Ultrasonication）-主要用于实验室破碎机理：可能与空化现象（Cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。通常采用的超声破碎机在1525KHz的频率下操作。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。,41,2021/3/11,超声破碎的适用性：,细胞种类：杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细胞比革兰氏阳性细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。超声波振荡易引起温度的剧烈上升，
13、操作时常在冷却条件下进行。小规模实验常采用间歇操作，大规模生产受限制。超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活，因而有一定的局限性。,42,2021/3/11,超声波破碎时，影响生物产品收率的因素：,1、温度上升当气泡破裂时，绝大部分释放出来的能都以热的形式为液体所吸收，为了避免高温，悬浮液应预先冷却到05，并且还应用冷却液连续通入容器夹套，即短期的声波破碎与短期的冷却交替操作，声波破碎/冷却的时间比率称为 “负载因素”。,43,2021/3/11,2、化学效应超声处理会引起诸如生成游离基这样的化学效应，它可能对某些需要的分子带来破坏性影响，但对破碎细胞毫无影响。可通过添加游离基清除
14、剂如胱氨酸或谷胱甘肽，或者用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。,44,2021/3/11,连续超声波破碎的实验室装置,由一个带夹套的烧杯组成，其形状和尺寸会影响悬浮液的流体动力学。对于刚性细胞可以添加细小的珠粒，产生辅助的研磨效应。超声波反应器内，有四根内环管，由于声波振荡能量会泵送悬浮液循环，用插入进出口管到内部烧杯去的方法，就可以实现连续操作。,45,2021/3/11,46,2021/3/11,影响超声波破碎效率的参数:,(1)、振幅 振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度 k。(2)、细胞悬浮液的粘度 粘度影响能耗并会抑制空穴现象。,47,2021/3/11,(3)、表面张力 添加表面活性
15、剂或从细胞中释放出表面活性物质(如蛋白质)，能显著地影响声波破碎效率。因为强烈起泡在气一液界面上会促使蛋白质变性和空穴清除，特别是应用高的功率时。(4)、被处理悬浮液的体积 大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。,48,2021/3/11,(5)、珠粒的体积和直径 添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴的形成有帮助，而且产生辅助 “研磨”效应，从而提高破碎效率。在相同珠粒填充密度下，随着珠粒直径的变化，k存在最大值。,49,2021/3/11,(6)、探头的形状和材料 对于一个能级恒定的功率，探头的振幅与其面积成反比，然而对于小直径的探头，声能限制在较小的区域并且效率低。特别是当悬浮
16、液的体积小的时候，能量在探头嘴附近被悬浮液吸收，强烈的涡流会变小。对于大的探头，声能消耗在大范围上，结果则使振幅更小。,50,2021/3/11,探头嘴通常用钛制造，因为钛具有良好的声学和机械特性以及对生物活性产物的低毒性。为了维修和替换，通常探头可以拆卸。除钛以外，还可使用其他材料如不锈钢或硬质钢，但是其声学和机械特性都不如钛，破碎速度也大幅度降低。,51,2021/3/11,(7)、细胞悬浮液的流速 在连续操作中，流速取决于细胞在反应器中的停留时间，并影响破碎的总收率。超声波破碎在实验室广泛应用，但在工业范围中还未采用这种方法，因为要向大量细胞悬浮液中通入足够的能量是很困难的。,52,20
17、21/3/11,X-press法,将浓缩的菌体悬浮液冷却至25至30形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。此法称为XPress法或Hughes press法，主要用于实验室中。,53,2021/3/11,影响因素： 高浓度的细胞、低温、高的平均压力能促进破碎。优缺点： 适用范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低、活性保留率高，但是，该法对冷冻融解敏感的生化物质不适用。,54,2021/3/11,酶溶法研究较广的一种方法,原理：利用酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。自溶法控制一定条
18、件，诱发细胞自溶酶使细胞破碎。自溶法常采用加热法或干燥法。外加酶法根据细胞壁膜的结构及组成选择合适的酶。,55,2021/3/11,细菌大多用溶菌酶(lysozyme)酵母菌常用溶酶有：-1,3-葡聚糖酶(glucanase)、-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶(protease)、甘露糖酶 (mannanase)、糖苷酶(glycosidase)、肽键内切酶 (endopeptidase)、壳多糖酶等。,56,2021/3/11,细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,G+ 溶菌酶、适量抑制剂G- 溶菌酶、EDTA放线菌 溶菌酶酵母菌 -葡聚糖酶霉菌 几丁质酶、植物 纤维素酶、半纤维素酶,57,2021/3/
19、11,酶溶法的特点（外加酶）：,（1）酶溶法需要特定的反应条件。（2）酶具有高度专一性，必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶或溶酶系统，并确定相应的次序。（3）酶溶法的优点是：具有选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,58,2021/3/11,（4）酶溶法的不足：溶酶价格高；酶溶法通用性差，且不易确定最佳的溶解条件；存在产物抑制，在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用。,59,2021/3/11,自溶法（Autolysis）,诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。影响自溶过程的主要因素有温度、时间、
20、pH值、缓冲液浓度和细胞代谢途径等。缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,60,2021/3/11,化学渗透法,某些化学试剂，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法(Chemical permeation)。常用化学试剂有：有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等。,61,2021/3/11,作用原理,化学渗透法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成，不同化学试剂作用的部位和方式有所不同，现举例如下:（1）表面活性物质：可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破
21、碎。如TritonX-100能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，从而使某些胞内物质释放出来。,62,2021/3/11,（2）EDTA螯合剂：可用于处理革兰氏阴性菌(如E.coli), 它对其细胞外层膜有破坏作用。（3）有机溶剂：能分解细胞壁中的类脂。（4）变性剂：如盐酸胍(Guanidin HCl)和脲（Urea）与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。,63,2021/3/11,各种试剂的不同作用机理，将几种试剂合理地搭配使用能有效地提高胞内物质的释放率。例：单独用0.1mol/L盐酸胍处理E.coli仅释放约1%的蛋白质 0.5% TritonX-1
22、00处理蛋白质释放率为4% 二者合用，蛋白质释放率可达53%左右。,64,2021/3/11,化学渗透法的优点：, 对产物释放具有一定选择性。可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。 细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,65,2021/3/11,化学渗透法的缺点：,（1）通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。（2）时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%。（3）有些化学试剂有毒性。,66,2021/3/11,反复冻结-融化法,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。一方面使
23、细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次。,67,2021/3/11,渗透压法（Osmotic pressure）,将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,68,2021/3/11,干燥法,原理：干燥法可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。它使细胞膜渗
24、透性改变，当用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就容易被抽提出来。,69,2021/3/11,空气干燥主要适用于酵母菌，一般在2530的气流中吹干，然后用水、缓冲液或其它溶剂抽提。空气干燥时，部分酵母可能产生自溶，所以较冷冻干燥、喷雾干燥容易抽提。真空干燥适用于细菌的干燥。,70,2021/3/11,冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质，将冷冻干燥后的菌体在冷冻条件下磨成粉，然后用缓冲液抽提。有机溶剂脱水：例如，丙酮等使细胞脱水，即可将菌体悬浮液慢慢倒入10倍体积预冷至20的丙酮中搅拌使之脱水，丙酮除能脱水外，还能溶解除去膜上部分脂肪，所以更容易抽提。缺点：干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白
25、质或其它组织变性。,71,2021/3/11,细胞破碎方法（按是否使用外加作用力）,72,2021/3/11,选择破碎方法的依据,（1）细胞处理量：大规模生产多采用机械法（通用性强，破碎效率高），实验室规模多选用非机械法（选择性好，固液易分离）。（2）细胞壁的强度与结构：见3.2。（3）目标产物对破碎条件的敏感性：对活性物质产品，要兼顾效率与稳定性。（4）破碎程度：操作条件要兼顾产物释放率、能耗和便于后提取。,73,2021/3/11,任何破壁方法都有局限性和不足，应根据破壁目的、产物的类型和位置，选用合适的方法，达到选择性地分步释放目标产物的要求。,74,2021/3/11,其一般原则为:若
26、提取的产物在细胞质内，需用机械破碎法。若在细胞膜附近则可用较温和的非机械法。若提取的产物与细胞膜或壁相结合时，可采用机械法和化学法相结合的方法，以促进产物溶解度的提高或缓和操作条件，但保持产物的释放率不变。,75,2021/3/11,3.4 破碎技术的发展方向,为解决破碎过程中敏感性物质的失活，杂蛋白太多以及碎片的去除问题，细胞破碎技术研究还应注意以下问题:,76,2021/3/11, 多种破碎方法相结合。即机械方法与非机械方法的结合等，如用细胞壁溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，在95MPa压力下匀浆4次，总破碎率可接近100% ,而单独高压匀浆法破碎率只有32%。,77,2021/3/1
27、1,化学法与酶法取决于细胞壁膜的化学组成，机械法取决于细胞结构的机械强度，而化学组成又决定了结构的机械强度，组成的变化必然影响到强度的差异，这就是化学法与机械法相结合的原理。,78,2021/3/11,细胞 酶法或化学法处理破坏细胞壁某些物质组成壁的机械强度 机械法处理细胞破碎率,79,2021/3/11,例：面包酵母细胞的破碎用溶解酶（Zymolyase）预处理，然后在95MPa压力下高压匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独用95MPa压力高压匀浆4次，破碎率只有32%。,80,2021/3/11,（2）与上游相结合,寄主细胞的选择：选择较易破壁的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌。培养过
28、程控制：在发酵培养过程的细胞生长的后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁存在缺陷，利于破碎，而有些胞内产物不经破碎即可直接渗透出来。,81,2021/3/11,克隆噬菌体溶解基因：在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件(如温度等)，激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。耐高温产品的基因表达：如果产品能表达成耐高温型，杂蛋白仍然保持原特性，那么就可在较高温度下将产品与杂质分开，这样既节省了冷却费用，又简化了分离步骤。,82,2021/3/11,（3）与下游相结合,细胞破碎与固液分离和产品提取过程相结
29、合，也即根据后处理过程的单元操作确定细胞破碎的方法和操作条件。必须从后分离过程的整体来考虑破碎操作，即破碎过程要易于细胞碎片的除净。,83,2021/3/11,3.5 破碎率的测定,破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即: Y(%)(N0-N)/N0100由于N0(原始细胞数量)和N (经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量)不能很清楚的确定，因此破碎率的评价非常困难。目前N0和N主要通过下面的方法获得。,84,2021/3/11,直接测定法(仅适合于机械法),利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞数，所以可用于破碎前的细胞计量。可是破碎过程中所释放的物质如DNA和
30、其他聚合物组分会干扰计数，此时可采用染色法把破碎的细胞从未损害的完整细胞中区别开，以便于计数。,85,2021/3/11,例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞呈现亮红色。,86,2021/3/11,目的产物测定法,通过测定破碎液中目的产物的释放量来估算破碎率。（多用于生产，必须有100%破碎率作标准数值比较）测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中蛋白质的含量或酶的活力，并与100破碎所获得的标准数值比较。,87,2021/3/11,88,2021/3/11,导电率测定法,导电率的变化是由于细胞内含物被释放到水相中而引起的。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。因为导电率的读数取决于微生物的种类、处理的条件、细胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含量，因此应预先采用其他方法来进行标化。（是一种快速测定法，应预先采用其他方法制定标准曲线）,89,2021/3/11,思考题,1、常用细胞破碎方法的原理、特点及适用性。2、机械法细胞破碎方法非机械破碎方法相比有何特点？3、超声波破碎的机理、超声波破碎的适用范围。4、简述酶溶法及其优缺点。,90,2021/3/11,本章结束！,