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1、多羟基二苯甲酮类化合物的合成表征与生物活性研究林其先 指导教师：古练权 马林* 第五届化学院创新化学研究基金，30(中山大学化学与化学工程学院，广州 510275)摘 要 本文合成了七个多羟基二苯甲酮类化合物，并用IR，HNMR，MS对其进行表征。首次研究了它们对蛋白质非酶糖基化，-葡萄糖苷酶，腺苷脱氨酶的抑制作用，获得满意效果，最佳半抑制浓度分别达到22.6，67.8，76mol/L。关键词 二苯甲酮、非酶糖基化、-葡萄糖苷酶、腺苷脱氨酶、半抑制浓度Preparation of Multi-hydroxyl Diphenyl Ketone Compound and Biological Ac
2、tivation ResearchLIN，Qi-Xian GU，Lian-Quan MA，Lin*（School of Chemistry and Chemical Engineering，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275）Abstract Seven kinds of multi-hydroxyl diphenyl ketone compound have been prepared. They were token with IR, HNMR and MS. The inhibitory action of diphenyl ketone to
3、 NEG，-glucosidase and ADA has been studied for the first time. Experimental result indicated that the multi-hydroxyl diphenyl ketone has a better suppression effect to NEG，-glucosidase and ADA. The best IC50 respectively achieves 22.3, 67.8 and 76 mol/L.Keywords diphenyl ketone NEG -glucosidase ADA
4、IC50二苯甲酮类化合物是指含有结构的有机化合物，由于苯环上取代基的种类，数目和位置上的不同而使其呈现不同的结构和物理化学性质。根据性质上的差异，可将它们应用于日常生活的诸多领域。例如二苯甲酮可用做光引发剂1，应用于涂料、油墨、粘合剂、电子器件、光纤材料等行业。其他的二苯甲酮类光引发剂还有4-甲基二苯甲酮、2-甲基二苯甲酮、2,4,6-三甲基二苯甲酮等。2,4-二羟基二苯甲酮用做紫外线吸收剂2，可以吸收290400 nm的紫外光，广泛应用于塑料、油墨、油漆、化妆品等领域。二苯甲酮类化合物数量繁多，当苯环上的氢被一个或多个羟基取代时，生成一类新的化合物多羟基二苯甲酮。这类化合物用途广泛，例如2,
5、2,4,4-四羟基二苯甲酮是一种高效水溶性紫外线吸收剂，属于二苯甲酮类紫外线吸收剂的系列产品，广泛应用于塑料、树脂、涂料、合成橡胶、感光材料及化妆品行业3-6。2,3,4, 4-四羟基二苯甲酮7，8是一种重要的有机中间体,用于微电子集成电路工业的光致抗蚀剂、医药中间体、紫外线吸收剂、树脂稳定剂、染料等。二苯甲酮类化合物的合成方法很多，主要有光气法9，苯甲酰氯法10，三氯甲苯法11，苯甲酸法12，二苯甲烷法9，格氏试剂法13等，其中苯甲酸法是合成多羟基二苯甲酮化合物常用的方法，例如2,4-二羟基二苯甲酮可通过如下反应合成：此法由苯甲酸与多羟基酚发生Friedel-Crafts反应一步合成，具有操
6、作简单，反应条件温和，产品收率高，成本低等优点。目前，多羟基二苯甲酮类化合物的研究主要集中在紫外线吸收剂和光引发剂上，而作为一种医药中间体，有关二苯甲酮类化合物生物活性的研究却很少有报道。因此本文在合成系列多羟二苯甲酮类化合物的同时，研究了它们对蛋白质非酶糖基化，-葡萄糖苷酶，腺苷脱氨酶的抑制作用。化合物的结构如下：化合物化合物化合物化合物化合物化合物化合物图1 系列多羟二苯甲酮类化合物Fig 1 Multi-hydroxyl diphenyl ketone compound1 实验部分1.1 仪器与试剂RF-5301PC型荧光分光光度计(日本岛津公司)；FLS92型组合式荧光寿命与稳态荧光光
7、谱仪(英国EDINBURGH公司)；UV-2450紫外分光光度计(日本岛津公司)；LCMS-2010A液相色谱质谱联用仪(日本岛津公司)；TENSOR37型红外光谱仪(德国BRUKER公司)；MercuryPlus 300核磁共振波谱仪(美国VARIAN公司)；PHS-25型酸度计(上海伟业仪器厂)间苯二酚(AR，汕头市光华化学厂)；焦性末食子酸(AR，国药集团化学试剂有限公司)；水杨酸(AR，广州化学试剂厂)；间羟基苯甲酸钠(CP，中国医药(集团)上海化学试剂公司)；对羟基苯甲酸(CP，国药集团化学试剂有限公司)；2,4-二羟基苯甲酸(CP，上海试剂三厂)；牛血清白蛋白(BSA，购自华美生物
8、工程公司)；对硝基苯酚葡萄糖苷(pNPG，Sigma公司)；酵母a-葡萄糖苷酶(Sigma公司)；腺苷脱氨酶(ADA，Sigma公司)；腺苷（购自上海伯奥生物科技公司）；其它试剂均为国产分析纯，所有测试用水为二次蒸馏水1.2化合物的合成称取间苯二酚5.5 g (50 mmol), 2,4-二羟基苯甲酸8.56 g (55.6 mmol)于250 mL三颈瓶中，加入27.2 g无水氯化锌(0.2 mol)，25 mL氧氯化膦，装上回流冷凝管(带氧化钙干燥装置)，70下搅拌回流2.5 h。将反应液倾入少量碎冰中，不断搅拌使氧氯化磷完全水解。于4冰箱中静置过夜。反应液抽滤，固体分别用蒸馏水，3% N
9、aCHO3溶液洗涤两次，得粗产品。用适量沸水重结晶(必要时活性炭脱色)，得产品2, 2,4，4-四羟基二苯甲酮，即化合物，沸点197.0199.0。其他化合物可按类似方法得到，反应时严格控制反应物料比，酚酸催化剂 = 50.0 mmol55.6 mmol0.2 mol。1.3 非酶糖基化抑制研究参照Yuanxia Sun方法，稍有修改。牛血清白蛋白(BSA)终浓度为2g/L，NaN3终浓度为2.5mmol/L，果糖终浓度200 mmol/L，碳酸缓冲溶液（pH=9.0）终浓度20mmol/L，样品终浓度分别为0，10，25，50，100，150mol/L，每个浓度设置2个平行样；另设对照：以同
10、体积的缓冲溶液代替样品; 不加果糖和样品溶液的纯蛋白组。溶液配制之后，置于50的恒温箱避光孵育10天后取样进行荧光光谱分析。取1.5mL的糖基化溶液用缓冲稀释到3mL，用FLS920荧光光谱仪，激发波长为340nm，发射波长为420nm，狭缝为1.5nm，扫描发射光谱，读420nm的荧光强度得出样品管A（F）值。应用以下公式计算化合物对BSA糖基化反应的抑制作用，用抑制百分率（IR）表示：然后以抑制百分率对抑制剂浓度作图，根据抑制曲线求得各种化合物的IC50值。1.4 -葡萄糖苷酶抑制研究将一定量活力为U/mg 的a-葡萄糖苷酶（浓度为1 mg/mL）溶于pH = 7，0.05 M的磷酸盐缓冲
11、溶液中，振荡1 min，于37下恒温30 min, 加入底物对-硝基苯酚葡萄糖苷（浓度为2 mg/mL），混合均匀后于= 400 nm处测量吸光度随时间变化的曲线。改变底物浓度按同样方法测试，以反应进程线的直线斜率为反应速率，将反应速率的倒数设为纵坐标，以底物浓度倒数为横坐标作图，得1 / V 1 / S 曲线，即酶反应动力学曲线，求得米氏常数Km值和最大反应速率Vm。在抑制剂存在下，按相同方法测试a-葡萄糖苷酶的活力，以反应进程线的直线斜率为反应速度，将该反应速度值设为纵坐标，以抑制剂浓度为横坐标作图，得 V I 曲线，求得抑制剂对a-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50 值。本实验条件下以每分钟
12、释放1.0mol PNP为一个酶活力单位。1.5 腺苷脱氨酶抑制研究取pH=7.5磷酸盐缓冲溶液750l到1.5ml的塑料样品管中，加入100l腺苷溶液(0.1mg/mL)， 50l乙醇，混均，加入100lADA溶液，测量在265nm出吸光度的变化，扫描90秒。以50l的抑制剂-乙醇溶液代替乙醇进行测试，将两次测得的结果进行比较，通过扫描直线斜率的变化确定化合物有无抑制活性。按照1.4类似方法测试，计算二苯甲酮化合物对腺苷脱氨酶的半抑制浓度IC50 值。2 结果讨论2.1 蛋白质非酶糖基化抑制研究实验发现：未加任何抑制剂的糖基化溶液随着放置时间的增长，溶液显棕黄色，而未加果糖的纯蛋白溶液透明无
13、色，这说明溶液中的蛋白和果糖发生了非酶糖基化反应。由于糖基化终末产物棕黄色物质能够在一定条件下产生荧光，当我们在糖基化溶液中加入了一定量的被测化合物，荧光强度发生变化，对于大部分的被测化合物而言，荧光强度变小，并且随着化合物浓度的升高，荧光强度在逐渐减小，我们初步推断这些化合物对非酶糖基化反应具有抑制作用，我们研究了糖基化抑制程度与化合物浓度之间的定量关系。得到了二苯甲酮化合物对蛋白质非酶糖基化的半抑制浓度IC50 值，如表1所示。由表1可以看出，五种二苯甲酮（2,2,3,4-四羟基二苯甲酮、2,3,4-三羟基二苯甲酮、2,2,4-三羟基二苯甲酮、2,2,4,4,6-五羟基二苯甲酮、2,2,3
14、,4,4-五羟基二苯甲酮）对非酶糖基化有不同程度的抑制作用。其中， 2,2,4-三羟基苯甲酮、2,3,4-三羟基苯甲酮和2,2,4,4,6-五羟基苯甲酮三种化合物的抑制活性是2,2,3,4-四羟基苯甲酮的两倍，2,2,3,4,4-五羟基苯甲酮的三倍。后两者在结构上有一致性，苯环上都有邻位酚羟基，而前三者没有邻位酚羟基，这说明：酚羟基的位置对其抑制活性起到非常重要的作用，相反，此时酚羟基的数目对其活性没有显著的影响。另外一种苯甲酮（2,2,4,4-四羟基苯甲酮）在340nm的激发波长的激发条件下，其在发射光谱的400450nm具有较强的吸收峰，因此我们无法通过分析荧光强度的办法研究该化合物对非酶
15、糖基化的抑制作用。表1 二苯甲酮类化合物对AGEs的抑制情况(P0.01)Table 1 Inhibitory action of diphenyl ketone to NEG(P0.01)CompoundsIC50(mM)CompoundsIC50(mM) 22.6 29.2a*46.575b*22.3注：化合物a*,b*数据由本实验室李满妹师姐提供2.2 -葡萄糖苷酶抑制研究实验研究了七个二苯甲酮化合物(2,2,4-三羟基二苯甲酮、2,3,4-三羟基二苯甲酮、2,4,4-三羟基二苯甲酮、2,2,3,4-四羟基二苯甲酮、2,2,4,4-四羟基二苯甲酮、2,3,4,4-四羟基二苯甲酮、2,2,
16、3,4,4-五羟基二苯甲酮)对a-葡萄糖苷酶的抑制作用。得到其半抑制浓度IC50 值，如表2所示。表 2 二苯甲酮类化合物对a-葡萄糖苷酶的抑制情况Table 2 Inhibitory action of diphenyl ketone to -glucosidaseCompoundsIC50(mM)CompoundsIC50(mM) 199.15144.07144.07173.73 67.8105.9370.34注：本数据是由王渝芳师姐协助完成结果表明，化合物和的抑制效果最好，IC50分别为67.8和70.34mmol/L，是化合物的1.5倍，化合物和的3倍，化合物和的2倍。构效关系表明，抑
17、制效果不仅与苯环上取代羟基的数目有关，还与其取代的位置有关。其中羟基越多，抑制效果越好，且间位羟基取代为必需，各取代位置对抑制效果的贡献为：间邻对，具有邻苯三酚结构的二苯甲酮其抑制效果最好。2.3 腺苷脱氨酶抑制研究实验研究了六个二苯甲酮化合物(2,2,4-三羟基二苯甲酮、2,3,4-三羟基二苯甲酮、2,4,4-三羟基二苯甲酮、2,2,3,4-四羟基二苯甲酮、2,3,4,4-四羟基二苯甲酮、2,2,3,4,4-五羟基二苯甲酮)对腺苷脱氨酶的抑制作用。得到其半抑制浓度IC50 值，如表3所示。表 3 二苯甲酮类化合物对腺苷脱氨酶的抑制情况Table 3 Inhibitory action of
18、diphenyl ketone to ADACompoundsIC50(mM)CompoundsIC50(mM) -8185- 10076注：本数据由代陪钢师兄协助完成结果表明，化合物、和抑制效果较好，化合物较差，化合物和几乎灭由抑制作用。构效关系表明，苯环上酚羟基的位置对抑制活性起主要作用，酚羟基数目对其活性影响较小。不同取代羟基对抑制效果贡献为：间(略)对邻。致 谢本文是在古练权老师、马林老师、王渝芳师姐的悉心指导下完成的，在此特向他们表示由衷的敬意和至深的感谢！同时要感谢化学与化学工程学院第五届创新化学实验与研究基金。最后还要感谢实验过程中每一位给予过我支持与帮助的老师、同学和朋友。参
19、考 文 献1 李鸿州、高天星，光引发剂的发展概况，甘肃化工，2000，2：542 程其时、马永国，二苯甲酮类紫外吸收剂的发展趋势，中国塑料，1996，6：33 NeumannP，AumuellerA，Process for preparation of 2,4-dihydroxybenzophenone PUS：4990680，1991-02-054 BEAUJP，Process for the manufacture of hydroxyalkoxybenzophenones PUS：5629453，1997-05-135 董研，2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮的合成，化学试剂，1997，19（
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