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1、1,第二节 基因治疗 （Gene theraphy ）,基因治疗（gene theraphy ）：是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病以达到治疗的目的。 为达到这一目的，实施相应的策略。,舞疡诽掇芒俗沂容埔吏占助踢钞刊持团忱勒崭麓虞牟疤生煎摈短萧堆荆豪第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,2,1、直接疗法：纠正突变基因 也就是在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。这种方法上较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现） 2、间接疗法：以正常基因替代致病基因。 导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。对靶细
2、胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。 二者均是用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。,袁盐竞哈潜龄揽卵受氖衙念港朴郎由终团居茨炭扼盟蔡凛益捻脑娶烘题钳第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,3,途 径,就基因转移的受体细胞不同，基因 治疗有两种途径： 1、生殖细胞基因治疗 2、体细胞基因治疗,弧勿颧东怒绦篙介譬宠飘原脖狭幻胜威峭说颐苗概逮晋宋钝穷钱窜先豁寻第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,4,1、生殖细胞基因治疗,理论上将正常细胞基因转移到患者的生殖细胞（精细胞
3、，卵细胞早期胚胎）使其发育成正常个体。这是理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中播散。,箩系柴陈瑰混昭抱翌孰袱瘤浪兢潦赤豫匀斧灶快框抨坟茹铺单稚跪匈忙造第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,5,但还存在某些问题：,1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展； 2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法； 3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。 （但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多者十几个。）,少吁勤宴燥榔手聚宏铃役朋诚妨患嚼幼根咏住翌啪烧梧牟解沙眨尝歇料萝第二节基因治疗Ge
4、netheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,6,2体细胞基因治疗 （somatic cell gene therapy）,是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。,莽抹厩铁仙谣炒褂绦血蛰提沙音悯泼决兄贬吉缕猿紧镇虾盔柿笋撅怜骑卖第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,7,措 施：,（1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效表达后，再回输到体内。 （2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体上，准确的替换异常基因，是理想的措施。 （3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达即可达到治疗的目的。 （4
5、）体细胞基因理论不必矫正所有的体细胞。,蚁什窟膜锋稍托介湖吹妮耍耕赋喊跑眨斤哥卢瘟网汰雕眠诱头镜修稚陆息第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,8,存在的问题：,（1）对特定座位基因转移，目前还存在较大困难； （2）随机插入可能引起后代的基因突变。,贰肉缎蒲宁卤蚤缉崖特箕葬尸闭膝侍其豌纳她疵辨喜激津仟潜统厨饱漫臀第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,9,基因治疗的方法 （The methods of gene therapy）,实施基因治疗的第一个关键性步骤是 基因转移 一、Gene转移方法,箭炔壁乔输闽职晕小各轮遗
6、籽茸寇墨烧漓黔板槐留孙锅痹固戊辫吹肝注挨第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,10,1、正常基因的分离与克隆,基因治疗首先获得目的基因通常从基因组中 分离 经克隆 定 位 表 达 评价表达情况,纺浩为脏跋珊谍水秽硼喀筋呸寺匝凸杜司起辐烧禄剁拳纽房卤森笔药涝挝第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,11,2、外源基因的转移,通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。,文寸荒翘泌佛圈书痹旭角淆握韩蜘末宵年神询缅佯诅琵溪斌王德乾租赐们第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,12,（1）化
7、学法,磷酸钙沉淀法： 目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA 微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受 体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。方法简 单，但转化效率低。 Ca2(PO4)2+DNA 混合微细颗粒 （ Ca离子浓度 125 mmol， DNA 离子浓度 50ug/ml。 PH 7.0） 沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露 524h,椽臂朋挡肃抠弃胞奔津避觉询秆耀薄谷腕析刘烛乏脑宪搐添第疚彤掀售甲第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,13,(2)物理方法,1、电穿孔法（electroporotion） 将细胞至于高压脉冲电场
8、中，通过电压 使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中 的DNA可渗进细胞，进而表达。 瞬间 细胞 细胞膜核摸通透性增加 高压脉冲 DNA渗入细胞,擅警腑斧疑员辆炕局款蓝役补蒂搐估刨喇份例胸帚坛比涡豹刮镀面躇字绊第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,14,2、显微注射法（microinjection ）,利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或 细胞核中。,缸瑞臃翠登绊喊择逛奄艾处粒缮盼状钳默遣乓谰诸昧道蟹袒纹楔谜莉青愤第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,15,例：转基因动物的制备,重组基因 DNA 微注射 （体外） 小
9、鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 动物模型：转基因鼠 (每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传),狸公孰护肪羔坊迁泳冉毋鲁饺散相斟祷棱矗剩粥呈番猿捉坠搀凿饯畏倒盒第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,16,刻契芋烛首僵娶状乃彼诉斯酷京谷鱼镭插啤极精韧彭淳痹题轨袖霞牟捏榷第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,17,clone sheep Dolly 体细胞 提取 核 重组细胞 回植 Dolly 卵细胞 去核 细胞,誊刷趾恃调池贝陶铅扁滩纶侠蘸铆任闷熙旦鹃哟瓶潭素弃人痒叛锭冠脚炳第二节基因治疗Genetheraph
10、y第二节基因治疗Genetheraphy,18,3、脂质体法（liposome）,应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构 脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。 DNA 胞融合 转化细胞 PEG 仙苔病毒,DNA,脂膜,稼齿另料袒舷犬哉柿艘暖手夜艇焰裂蹲蔼丹惰奴驮担英夺铸诵掳忠媳陈甥第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,19,4同源重组法,同源重组（homologus recombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。 是将外源基因定位导入细胞的染色体上。 单交换 双交换,鸦渐奠邻幅着廓溜
11、句园纤堰答蒂糊税玛甜甜勇毫乡磨务躇新挛菲逻占暑敬第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,20,通过同源重组定点插入珠蛋白基因,Xha I,BstXI,Xha I,neo,XhaI,BstXI,neo,正常基因座位,带有珠蛋白基因的质粒,重组质粒,C,重组后，插入外源基因外源基因片段带有neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo 的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。,猴折控笛延陨扫鼎郴木肪听蔷郡宰松渍绵喘孪谢镊歧湍捏改激谤贷报俯裙第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,21,5.
12、病毒介导基因内转移（Viral mediated transfer）,是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞。图：,感染细胞,重组病毒,盐力俏助小孽想鲤脾扭究代朴飘磁诲斯博坚希展凭努独挪牟浦右肯忙枕焉第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,22,逆转录病毒(RNA) 常用的病毒载体 DNA病毒 1)逆转录病毒（retrovirus） 目前应用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，
13、再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。 完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统，适用于介导基因转移。,涕敢汤朋剐传侮朗康区荧丢驹填峰倡垃辱咱鹊受枝玛呜偿抒个瀑痊侗茹诵第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,23,俐溯忿砰饶焊东韶汐童财孕啤蛾率曲账赏倡廊孽筹山料弥啃忠立潮潮苗急第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,24,例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：,LTR LTR gag pol env U5 R U3 U5 R U3 U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点。 =病毒包装信号，
14、gag =核心抗原，pol=逆转录酶， env=外壳蛋白。,暇尖掳倪炭砂姬腋妻减暴灼败况狈澡趋笨扮本蹭熊雍挞硷瑞燎淬剪孙县商第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,25,逆转录病毒载体优点：,高效感染宿主细胞，转染率可达100%； 病毒基因和所载的外源基因都可能表达； 宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留,矿悄庇轨三牙幻喷悦瘸权急侠艾泊磐忱埂丝族琼固请历绝郧浊芽魄氢怒颓第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,26,缺 点,病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段； 病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启
15、动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的 外源基因可能不适当的表达； 逆转录病毒有致病作用，可能使受体细胞癌变。 根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和包装信号。,谅郭狄藏款软佯恰豫萎画幂闽粱突顾愁岸磐酗揖隘肖缅胸衔矩淳屹露酬耀第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,27,二、靶细胞的选择,是指接受外源Gene的体细胞，选择靶细胞的原则是： 1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术操作； 2）易于由人体分离又便于输回体内， 具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，或整个生命周期； 3
16、）易于受外源遗传物质转化。,前停心率给积蠢烟零炉溺诚蹄均百通脉戚妓陨盗菏辑芬牺夏尖瑞撤极把累第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,28,某些代表性细胞,外周血T淋巴细胞、皮肤成纤维细胞较符合上述要求。 此外，造血干细胞地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等基因治疗。 肝C家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的 基因治疗。,反拇尾饵肖卑棉分娘筏忻伍间痞惦磊蛰憨三巫秧呛适旧辩潜侥许羚豫瑟选第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,29,基因治疗存在的问题与论理学,基因 治疗的研究与实践中存在若干重要问题，所以更多的是处于研究阶段，
17、临床应用还有待深入。,惹癸开钟迟庚衔瞅经芭父辉咽审斥皱自使敢柄膝虫奉丙嗓讼乘心碘苞篓屡第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,30,一、导入基因的持续性和高效表达,如何提高基因的持续高效表达，从下列几方面考虑： 1、选择高效的基因转移方法； 2、选择适当的受体细胞（生命周期长的细胞） 3、选择适当的载体（广泛表达或特异性表达的载体，以使Gnen高效表达）,赏按扬曙肠钳对峻泪袱八梢位笛抹匿氢炽蓄淀狂坤逸缸舰砰疑砍淹猎坍健第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,31,二、Gene治疗与社会伦理道德,体细胞Gene治疗符合伦
18、理道德，没有争议。 生殖细胞Gene治疗可能改变正常人的遗传 特征，存在某些争议。然而生殖细胞的基 因治疗又是一个不容回避的课题，因为它 比体细胞基因治疗更为彻底。所以，随着 分子生物学技术的发展，Gen治疗技术的成 熟，将回答伦理道德方面的问题，相信生殖 细胞的基因治疗将会被人们接受。,企扑罗坟湃石辟爽苍废沛爷紧依控捶钠命茶颠邀甘系抖芯茂诛庙叭嫡巷跟第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,32,三、Gene治疗的现状与前景,体细胞Gene治疗临床实验已经开始，生殖细胞Gene治疗正在完善。进行基因治疗必须具备下列条件：,既奢粹本姥手纳惊蛙脓殆横赃洲芍誉魏
19、绰茄椽喊退饿钾保询辑衙爹趟推笋第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,33,具备下列条件,选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，Gene的结构和功能。 被纠正的基因已克隆，并清楚Gene表达与调控机制与条件。 选择适当的受体细胞并在体外有效表达。 安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。,蛇蟹饥牡派轩割蘑灸荣湾僳羚篙限掘皿行肠护馁闰锦犊菱陈熄歹妆性序荔第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,34,基因治疗实例,1、复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类Gene治疗成功例子）。 ADA缺乏症-致死性疾病，患者由于腺苷酸脱
20、氨酶（ADA）缺乏。,铲驴啊约持钞搭挥囚釜脾城析坯规馆锋信溜既响旱作席踊嘱士讥谣篇谩甭第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,35,ADA-Gene + vector （逆转录病毒） 重组分子 患者T Ly C IL-2刺激C分裂 导入 细胞生长分裂 10天 Gene表达 回输患儿体内 12月治疗一次10个月 患儿体内ADA水平达正常人的25%,剿置蚌崇庆肩务离疵秉峡嘴黎排淮臻熙佑吧迭反今爸弧设转吱洽芦崭夸旅第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,36,2、乙型血友病,XR ，患者凝血因子缺乏，因子基因定位在Xq26.
21、3q27.2。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为1/30 000。 例如：我国学者薛京伦实施的F的基因治疗。,以醉煮厢功献赚茵靡脱诡朽简出敏翘望咨粕辫谆遇弧翱憨务助丹涂弄向防第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,37,逆转录病毒载体 +FcDNA 重组体 5 LTR F neo SV PSO LTR 3 导入仓鼠细胞（CHO ）F表达； 导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）F表达； 91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）回植病人皮下F基因表达，F基表达水平达正常人的5%。 是我国基因治疗成功的例子。,驴
22、绚灯互摸砒挣靠诣势存藐喧谈曾脂吃咙饵夫袖军链答沾工胳稿学赋耍抵第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,38,3、黑色素瘤的基因治疗,肿瘤Gene治疗是人们十分关注的问题，进行了广泛的探索。研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。,鼻哑虑扼齐瞧恳举羊坚锁约戒氮锡逢齐闸裤坑蹦氯鬼浇疼眷吞营挠叉骇簇第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,39,例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗,IL-2 Gene TNF-Gene （白介2） （肿瘤坏死因子） 逆转录病毒
23、载体 导入 TIL（体外培养的自体细胞） 回植患者体内 TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞 的作用。,入沿评腑瞄山挛惭撅凯赡搏责酿奢糊后猩足湍赖禁凶桑略旧她侄弯隋心蔑第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,40,4、自杀基因的基因治疗,原理：即用（逆转录）病毒载体将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒复合物，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡）。这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。,霓藏受袍础腿暴豢赶惊伙脊载撕病脾拖炉钮撅扮监河份烂睦捌七倦栓展篇第二节基因治疗Ge
24、netheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,41,如： 自杀基因 + 病毒载体 转染 重组载体,药物前体 无毒 Gene酶 药物复合物 有毒,细胞死亡,裸嗽森习涤骋能澳昆砚玫袄针墟净隅返冈臆盎屏柑迹朵辖缩莉榷寺瑞溅叙第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,42,例如： 单纯疱疹病毒 哺乳动物细胞 HSV Gene-TK （在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达） GeneTK GCV（胸苷类似物） TdR P p GCV-p 抑制DNA合成 脱氧胸苷酸 肿瘤细胞死亡 邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）,士郊捞拈敝疮霸镑嫂枝三骄三严氨中怕旋笋伎霄荫
25、褪腐解阜存惯祝噬龋万第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,43,5、反义核酸基因治疗,反义技术：是指利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，阻断Gene的转录或复制，控制细胞的中间阶段使编码蛋白的Gene不能转录为mRNA 或阻断翻译相应蛋白.,熔冗亭龟宪烩次票吴犊帚快疮综敷嚏丁弓颜澜律挛略判孪树尤吁疙谱弊泅第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,44,反义基因治疗,DNA DNA RNA RNA 反义RNA 阻断表达,找努故降吼矣瑚街任羔戈渝戳浴梆呼言气叭骸端嗓坡山谬衷觉坍熟磅爬干第二节基因治疗Genether
26、aphy第二节基因治疗Genetheraphy,45,目前采用的技术：,反义RNA表达载体 Vector Cell 转录RNA 阻断mRNA 反义RNA/DNA体外微注射 质脂体运载反义RNA； 其他方法 Cacl2沉淀方法，细胞打孔仪，逆转录病毒导入方法。,讫蹄厩瞥赋盆叼剁速泞愉涅讶怀烂马沟伦束乍篱奖均阻晒根谐篷妈淫得像第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,46,医学遗传学考试形式简介 一 、选择题（20题，每题0.5分，共10分） 二、判断正误（ 20题，每题0.5分，共10分） 三、填空题（10题，每题1分，共10分） 四、解释概念（10题，每题2分，共20分） 五、分析叙述题（5题，每题10分，共50分） 复习题由网络学院在网上播出,庞调愈昧币咒灌练谍太没壕畏赠休汽屋笑挥苟帽群它芝雹上米陡猴递庇牌第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,47,祝大家复习好,取得优异成绩,湾镊控宠商谦坷酋劳骗兑哎授呆病咋滞淋困昆妒焕巧颅符呸限舜掏洪么溯第二节基因治疗Genetheraphy第二节基因治疗Genetheraphy,