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1、人们只有将新的天然产物纯化之后才能进一步利用谱学技术鉴定其化学结构，测定其理化性质和生物活性，同时提供其作为制药原料、标准品或供做合成工作的起始原料。从一个粗提物中获得纯的化合物通常需经过许多纯化步骤，这些步骤烦琐、耗时。且花费较大。有时，所需化合物得率很低或性质不稳，因而,需要有尽可能多的分离方法以供选择。尽管有时也可能犯这样或那样的错误，但今天人们已有可能通过对各种方法进行审慎地选择来设计一条恰当的快速分离路线。,归坷弦矽子阑具生粹魂茁庙磋腕匙冉临楔宾援嚷弟塞抵吗懂娱蓑徽涪萧遗制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,肢诣言猿袭奋柜腐杀糠劳吝扎形缩惧逆诵茨跳拯惧钎热晶口泌姿瞬氧腿捏制备色谱应用
2、-s1制备色谱应用-s1,纤笛枫惫镣际粹丑侥第溺辊纬绪蓬芬挛债元馆爆盯加君贷泼货兢付锡蝇疼制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,Joumal of Chromatography Joumal of Liquid Chromatography and Related Technologies Analytical Chemistry Natural Product Reports Phytoehemical Analysis LC-GC Magazine及其他各种专业杂志上 徐任生、陈仲良主编的中草药有效成分提取与分离，第二版，上海科学技术出版社，1983年，1989年第二次印刷) 植物成分分析
3、，谭仁祥主编，,参考文献,魂踪往址滴桥堑堑杨凶喉乖钓遭焦熙涝桃佩贡翱胳见窿捎郸辑酵攀蔑肮芋制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,提驻摩双擒蛆巧贡馒岔淬腔父砖骨剁晾耻着米窑锣破荧缚鲸辅危炽迅匙冶制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,第一章 样品的制备与纯化,样品的制备对于复杂的分离与纯化非常重要。恰当的样品预处理可免去后续操作过程中的许多麻烦，使分离纯化变得更为容易。无论样品是来源于混有蛋白质的生物体、生产中混有残存催化剂的工业制品，或混有干扰杂质的植物体，通过简单的预处理就可以除去其中大部分不需要的物质。 样品的预处理特别适用于需要使用昂贵的制备型高压液相色谱柱时。尽管制备样品的目的不尽相同，
4、但其中许多操作与分析型高压液相色谱中所采用的一样。当处理生物样品时问题可能更加复杂，因为样品不仅可能含有复杂的大分子，而且还可能混有前面纯化过程中残留的缓冲液、盐及洗涤剂。因此，必须在预处理中去除上述污染物以免污染高压液相色谱柱。 在设计纯化方案时，通常先使用高效与低分辨率的预处理方法，其中包括一些经典的方法，如选择性溶剂提取、过滤、沉淀、透析、离心及简单的常压柱色谱分离等。而一些较新的方法，如超临界流体萃取、固相萃取等则更具有快速、高效的优点。 生物分子(尤其是生物聚合体)与常见的次生代谢产物性质明显不同，需要使用特殊的预处理方法。除常用的离心、沉淀(如用硫酸铵沉淀蛋白质)、离子交换及凝胶过
5、滤等方法(Wehr，1990)外，可用透析、超滤等专用方法。,妙墓举乏镣蜘滚天掘遇报怕铅藕品没都峰于乌稻慑脆媳驻哟他灯化私缠么制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,1中药化学成分概述 成分分类 生物碱 有机胺类 吡咯类 吡啶类 莨菪烷类 喹啉类 异喹啉类 菲啶类 丫啶酮类 吲哚类 咪唑类 喹唑酮类 嘌呤类 甾体类 帖类 大环类 其他类 苷类 黄酮苷 蒽醌苷 皂苷 强心苷 香豆精苷 挥发油 有机酸 蛋白质 氨基酸 树脂 糖类 鞣质,纵争烃澡春襄另滚郝挥净浅鹅伶账懦咽退宛漫惮橙镀痔蚤便声砚冲析疟修制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,中药化学成分预试,一、样品的制备 取通过20目筛的中草药粉末5克
6、，加入50毫升95乙醇，在水浴上回流加热10分钟。过滤，滤液浓缩至1/2量，得“乙醇提取液”备用，此提取液浓度为每5毫升相当于1克生药。 二、操作方法 取直径125厘米的普通圆形滤纸(新华牌或其他牌号，要求质地较细)一张，滤纸中心处打一小孔、备插入滤纸芯之用，将O1毫升乙醇提取液仔细滴加在距纸中心约1厘米处(如图1所示)。,圆形滤纸层析预试法,特轧搽度蛹婪钒遍腰邪鲤启钎劲吃龙际俗名楷熔辛炮镊恕持巨贵雹溃廉嚼制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,一张圆滤纸可同时点上810个样品。样品滴好后，将一小条滤纸芯插入滤纸的中心小孔。移到盛有展开溶剂的直径为12厘米的培养皿中，滤纸芯浸在溶剂中，滤纸上再盖
7、以同样直径的培养皿，以进行层析(如图2所示)。溶剂的前沿达到滤纸边缘后，取出滤纸，待溶剂挥发后，根据情况，喷上显色剂。 如果要测定不同样品中同类成分的分布情况，则可在一张圆形滤纸上分别滴加各种中药(最多可滴加10种)的乙醇提取液，用溶剂展开后喷同一种显色剂。当欲观察一种样品中几种成分的分布情况，则可滴加10个同一种中药的乙醇提取液，经溶剂展开后，将滤纸剪为10份，分别喷以不同显色剂。,宜甄率候氢旗钡君攀姬麦绒疙莆颇送煌猫绥粮痛综瓷翼嗜漫泻尹一七与即制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,三、展开溶剂 以甲醇或95乙醇为展开溶剂。可采用重蒸馏的工业规格的溶剂。 四、显色剂 优点是节省原料、试剂和时
8、间，还可以防止试管反应中由中药颜色造成的假阳性。,专恼袒检拽胶御砰宙挟鱼盛妊钙逢菌雨剩越衬脆版召出完摊职技姥粘蝉却制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,二试管预试法 1样品制备 （1）酸性乙醇提取液 称取通过20目的中药粉末10g，加70ml0.5%的盐酸乙醇溶液，在水浴上回流加热10min，趁热滤过，得酸性乙醇提取液。此滤液用以检查酚性成分、有机酸和生物碱。 （2）水提取液 称取通过20目的中药粉末10g，加水100ml，在室温浸泡过夜，滤取10ml滤液，供检查氨基酸、多肽和蛋白质等。剩余的药渣及浸液在60水浴中加热10min，立即过滤，此滤液供检查糖、多糖、皂苷、苷类和鞣质等。 （3）甲醇
9、提取液 称取通过20目的中药粉末10g，加入70ml甲醇，在水浴上回流加热10min，趁热滤过，滤液供检查黄酮及其苷类、蒽醌及其苷类、强心苷、香豆精及其苷类、内酯、挥发油、植物甾醇和油脂类等。 （试管反应因中药颜色深，容易造成假阳性）,中药化学成分系统预试法 1单项预试即直接寻找生物碱、苷、。 2系统预试法 常用递增极性溶剂法,膛惊灰疫墒倍索尝辆是炒租旅绕觉嫉察痹庚沙栅难胆切柳午钩葱垒肾蕴兼制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,系统预试流程图,中药粉末（6g干品或12g鲜品） 甲醇60ml，温浸过夜，滤过 中药残渣 滤液 回收甲醇 2%醋酸，15ml温浸20-3-min， 滤过 提取物 中药残
10、渣 酸液 合并加醋酸调pH5-6，用乙醚：氯仿（1：1）提取3次 酸水液 乙醚：氯仿液 氢氧化铵碱化氯仿提 2%碳酸钠溶液提取 碱性水液 氯仿溶液 水液 乙醚氯仿液 盐酸中和浓缩 脱水回收溶剂 盐酸酸化 部分丁 部分丙 乙醚提取 3/4量 1/4量 乙醚液 水蒸气蒸馏 部分甲 水溶性成分（糖、蛋白 碱性成分（生物碱 脱水、回收 不挥发部分 馏出液 （中性成分） 质、皂苷、鞣质及其他 和其他胺类成分 部分乙 乙醚提取 乙醚提取 水、溶性高分子化合物、 酸性成分 部分甲b 部分甲a 各种亲水性苷、水溶性 （有机酸及其他酸性成分）（中性非挥发性成分 中性挥发性成分 生物碱） 油脂、蜡、 树脂、甾萜、
11、 酚类、 植物色素等）,淀鄂右鲜送氓烫扰惟秩抵醉艘地戒惶烷烤遭撒悼茬台续备殿聂日鸭嘎看锄制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,溶剂混溶性表,发鉴布篓娄红枚蒂痛弄撬逐讹蜜鹿涅宫其悟溢夕臼褥操钝杀漱剧蓖畏叙却制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,中药化学成分提取基本方法 21 提 取,合理地选择单一或混合溶剂进行提取是保证正确的样品制备的第一步。首先以低极性溶剂提取可得到亲脂性的组分，而用醇类溶剂提取则可得到大量的极性与非极性物质。若开始阶段采用极性大的溶剂提取，则接着可用溶剂分配方法将提取物分为极性不同的部位。 在提取操作的各种方法中，搅拌与机械振荡是常用的方法，此外还有渗滤或加压固液提取等手段
12、。在加压固液提取法中，将干燥的植物装在柱中，用泵加压使提取溶剂通过柱床。Dionex公司生产的适用于该方法的一种提取装置ASE 200(Accelerated Solvent Extraction)，据称每次提取只需20min提取温度也可调至高达200，并可选择三种不同大小的提取器：11，22和33ml。尽管该仪器价格较高，却代表了提取技术方面的重要进步。 在蛋白质的纯化过程中，提取物的制备是关键的一步，其中有些需要特别注意之处，如有时可能需要加人缓冲溶液、洗涤剂、辅因子或其他一些试剂。,爬颇松疡眷佳逞孤萧埋陕桓挽始篡争庐曰灌藻祥旭笋室骨瞒跨潜本沈卧五制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,（1
13、）溶剂法 水甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿苯石油醚 冷浸 煎煮 回流 渗漉 连续抽提 （2）水蒸气蒸馏法 （3）升华法,颐产腮椽宙柴派启懂扁叮沏奇棍宝侄癌敖香越宦州输哨顽腾摩祁新框坛馋制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,2.2溶剂的极性 溶剂的极性可以大体根据介电常数()的大小来判断。常用溶剂的介电常数及其极性排列如表1-5所示：,勿咽凉呈告理缠别耻芳铰铁疟氖渐权互语页肺驶块社误加惜瓣破呆怨无幢制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,2.2.1 官能团的极性,悼泞贝尊骡搔助缄累措挥残挛听击烃兜煽告勋启瓤笛涟黔循啪淤海胖摸纫制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,(2) 化合物的极性则由分子中所含官
14、能团的种类、数目及排列方式等综合因素所决定。以氨基酸来说，分子结构中既有正电基团，又有负电基团，故极性很强。高级脂肪酸，如硬脂酸，虽也含有如羧基这样的强极性基团，但因分子的主体乃由长链烃基所组成，故极性依然很弱。又如葡萄糖，因分子中含有许多-OH基，故为极性化合物，但鼠李糖(6-去氧糖)及加拿大麻糖(2，6-去氧糖)因分子中CH20H及CHOH分别脱去氧变为CH3及CH2，故极性即随之降低。,踪予箭七稀古枣钧灿刊匙埋激渤饭日哗叫冗屹票揭残擞守您撬燎筏梁彰掠制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,再如，从黄花夹竹桃果仁中曾分出下列七种成分。(表1-4)。,苦搭狂侥遂酋锅享狙炮瓦诛声甲关食屉灯狂奠涵
15、弘以斗很匀羊绣袒匪喷丢制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,其中，与黄夹次甙相比，黄夹甙A、B因为分子中多出2个glc，故极性要大得多，并以甙A(R=CHO)甙B(R=CH3)。 五种黄夹次甙中，AD的结构差别仅在R不同，故极性大小即取决乎R的种类，并排成下列顺序： 次甙D(COOH)C(CH2OH)A(CHO)B(CH3) 又，单乙酰黄夹次甙B与黄夹次甙B比较，-OH变为OCOCH3，故极性还要降低。 综上，黄花夹竹桃中七种强心甙的极性将按下列顺序排列。甙A甙B次甙D次甙c次甙A次甙B单乙酰次甙B。 上述极性强弱顺序决定着这些化合物在硅胶上的吸附行为及柱层析时的洗脱规律。 应当强调指出，酸性
16、、碱性及两性有机化合物的极性强弱及吸附行为主要由其存在状态(游离型或解离型)所决定，并受溶剂pH韵影响。以生物碱而言，游离型为非极性化合物，易为活性炭所吸附，但解离型则不然，为极性化合物，不易为活性炭所吸附。因此实践中常可通过改变溶剂pH以改变酸性、碱性及两性化合物的存在状态，进而影啊其吸附或层离行为达到分离精制的目的。,蹬肥心佬挎举腊蜘唯假矢撅着爽酸合庄释惧馏盖暴某加缉怂琳留奥僚思砚制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,2制备色谱用样品的制备与纯化 2.1 提取,水层 石油醚液 用氯仿或乙醚萃取 水层 氯仿或乙醚液 乙酸乙酯萃取 水层 乙酸乙酯液 正丁醇萃取 水层 正丁醇液,中药粉末 用乙醇
17、提取，滤液，回收乙 醇，用水混悬，用石油醚萃取,埋确南庭墒亢富检钞胸绊采烷慢互拂橇绒譬表杰玄动随鞭颊梅诉铣面辫呜制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,乙醇浓度的影响 95%乙醇可提取生物碱、挥发油、树脂和叶绿素； 6070%的乙醇可提取苷类成分； 4050%的乙醇可提取强心苷和鞣质； 2030%的乙醇可提取蒽醌及其苷类成分； 水对植物细胞的穿透力最强，因此用有机溶剂进行提取时一般可以先以水浸润干燥后再提取。 渗漉与加压固液提取 渗漉是不加热的连续抽提，缺点是溶剂用量大，回收费时，优点是不受热，溶剂可以套用。一般到无色或渗漉液体积相当于药材量的10倍时可停止渗漉。 加压固液提取 是将干燥的中药粉
18、末装入柱中，用泵加压使提取溶剂通过柱床，Dionex公司ASE200型提取器，每次提取20min即可，提取温度也可调整到200其规格有11、22、33ml的。,禾蓑蔬羹逮好拽鹤充周哇亮竖夷羌呜叶弯马趁两廖捉输睁士挟衍崩搞橡李制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,一般提取分离情况有2种，即已知化学结构类型的成分和一无所知的成分。对于已知结构类型的成分可借助文献等设计分离方法。而对于无任何信息的中药，关键是先有疗效，然后跟踪分离。先做化学成分预试，然后设计提取分离方法。 1各种试剂对化学成分的溶解度都不是绝对的，有相互夹带，需注意； 2有机溶剂的渗透性差，所以用有机溶剂提取前可先将中药用水润透，干
19、燥后再用有机溶剂提取，效果会更好； 3中药水提液如处理不及时，因其中含糖、蛋白质等营养物质易发霉，为防止发霉，可加入少量甲苯、甲醛或氯仿等做防腐剂； 4用水渗漉时，有时室温较高，在渗漉过程中，中药会发酵，为防止发酵可用氯仿饱和的水进行渗漉；,提取过程中的几点经验及注意,惯瞄接春勺干氟纠化拎墒襄开谁饶谱咱壕阳酒信说涨哩罪垒厘逢娱糠尹矢制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,5水提取和减压浓缩时产生大量泡沫，给提取和浓缩造成困难，通常可在蒸馏瓶上装一防泡球加以克服；如图2-2或改用旋转蒸发仪，薄膜蒸发，喷雾干燥，冷冻干燥等。 实验室可加入消泡剂，如吐温、司盘、豆油；丁醇、戊醇等。 6提取苷类中药时为
20、防止水解，可先将中药粉末加醇煮沸片刻，以杀酶保苷，在提取氰苷和蒽醌苷时尤需注意。也可蒸30min或50min，根据药材质地而定。或直接用醇等有机溶剂提取；（或用硫酸铵等无机盐盐析使酶沉淀除去，鲜中药低温烘干60以下，将生药粉末在低温下与等量的硫酸铵调成糊状，装入布袋，压汁，药渣用有机溶剂提取原生苷。） 7提取次生苷时则利用其酶的活性，自身酶水解。（中药粉末加等量水拌匀湿润后，在3040保持612h以上，进行发酵酶解，然后在正常提取分离（如狄戈辛和西地兰）。,佰耪衰钠悉腋握消授跺著栋镣力铆蓬蜕妇郁盔竣颐淫笨浊欠续花旅荡仁虞制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,2.3 溶剂分配 溶剂分配主要是根据
21、待分离物质在不相混溶的两相中分配系数的不同得以分离。是一种简便快捷的方法。在得到提取物之后，接着用溶剂分配可除去大量外来杂质，特别是在进行生物活性跟踪分离时可快速得到富含所需成分的部分。如用于从植物中寻找抗肿瘤成分，抗HIV的活性成分，生物碱成分，对紫杉醇的初步纯化等。 在从植物中寻找新的具有抑制HIV活性的化合物时，一以1：1的二氯甲烷与甲醇及甲醇相继提取植物材料时，对各部位进行溶剂分配。具体方法如下：将粗提物首先在己烷与10%水-甲醇之间进行分配，极性大的下层调至含水25%，用四氯化碳进行分配，上层加水至含水35%，用氯仿继续提取；当从水相中蒸除甲醇后，用乙酸乙酯对剩余水相进行萃取。在用上
22、述方法对马来西亚藤黄科植物Calophyllum lanigerum进行研究时，植物中具有抗 HIV活性的物质集中于己烷与四氯化碳提取部位。对这两个部位进行进一步分离，得到一系列calanolides香豆素类物质。 Gustafson等（1992）用类似的溶剂分配法从大戟科萨摩亚植物Homalanthus nutans中分得一个极性相对较大的12-去氧巴豆醇（12-deoxyphorbol）酯类化合物Prostratin，并发现它可以抑制HIV-1的细胞杀伤作用。,氓目酵宠付菌察嘉芦厂平办淡已伪鉴炊禹楞淄巾柏评稗草涡撅潮变兜茸挨制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,Prostratin,他越桐
23、槛悯徘陵逢携赴晌慎局畸靡训稀抄霖优渤缘敬狮诀空单檀肌瞻辛龙制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,从植物材料中分离皂苷时，用丁醇-水分配方法可使皂苷类成分富集于丁醇部位，从而起到初步的纯化作用。通常先将含皂苷的植物用石油醚或二氯甲烷脱脂，然后用甲醇等极性溶剂提取。提取物用正丁醇-水分配可除去溶于水中的糖类和其他高极性成分，接下来可对正丁醇部位进行色谱分离。从具有灭螺活性的尼日利亚豆科植物Tetrapleura tetraptera 中分离三萜皂苷成分，就是用上述方法的一个例子。对正丁醇部位先后进行常压硅胶柱色谱分离、中压色谱分离和凝胶过滤，可得到所需要的皂苷成分。 多次的溶剂分配对将要进行液相色
24、谱分离的样品也可起到初步的纯化作用。如用由一定数量的分离管组成的Craig逆流分配装置或液滴逆流装置进行分离，尤其适用于从极性较大组分中分离亲脂性成分。Gross等（1986）从忍冬科植物Sambucus ebulus的根中分离一环烯醚萜酯苷ebuloside时，先将丁醇部位进行逆流分配，采用氯仿-甲醇-水（43：37：20）溶剂系统，经过200次转换的逆流分配，得到了ebuloside粗品，然后再进行精细的色谱分离。,陨扬韵茬底玩蝗鬼吹芦理苹点香盆予旋水牟驼洽筷绰盂妹雌呆泉以舜搪该制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,ebuloside,部热衰径猴此迫瓢猿侵祷崇惑猩输卿吸叮歉烤瓢唤展术灵痕婉
25、需柜奠锅普制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,2.4滤过 滤过是在分离之前的最基本的操作，以除去颗粒杂质。可以用绢布、滤纸、垂溶玻璃漏斗等。 此外，也可使溶液通过装有硅胶或其他填料的短柱进行纯化，这样可以除去其中有强吸附力的污染物，这些污染物在进行柱色谱分离时可能会产生不良的后果。 滤过困难的时候可采用离心的方法，现今还有用絮凝剂或澄清剂的。 2.5 凝胶过滤 在色谱分离前使用象Sephadex LH-20一类的分子排阻凝胶色谱也是常用的样品净化手段，有利于样品的进一步分离提纯。（详见该章） 2.6 沉淀 可自然沉淀和试剂沉淀，自然沉淀是除去溶液中的颗粒杂质或热溶，冷不溶的杂质，也可用生物碱
26、沉淀试剂，也可有醇提水沉或水提醇沉，以除去杂质。作为一种初步纯化方法，沉淀还经常被用于皂苷的研究中。将含有皂苷的提取物，（如经过丁醇水分配之后）的浓缩甲醇液倾入大量的乙醚中，利用滤过或离心的方法收集沉淀的皂苷。反复利用这种沉淀法可达到更好的效果。,浩俗褂妻匣包瓣校滚尊蔓瞩肚襄簇耻儒灿僻属岗型茵翁鲍凭锗臣岭鲤物懦制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,2.7 色谱分离的固态上样法 拟进行柱色谱分离（各种柱色谱，干柱、减压柱、加压柱等）的样品在洗脱剂中溶解度不佳时，可采用固态上样法。首先将样品溶在适当的溶剂，然后加入5倍量的失活吸附剂，（或硅藻土），将该混合物在3040下用旋转蒸发仪蒸干，然后把所得
27、的粉末撒到色谱柱的上部，样品上要盖上一层净砂或粗硅胶，或玻璃珠，以保护样品的平面，保证层析效果。 2.8 脱除叶绿素 一般脱除叶绿素的方法可以是醇提水沉或直接用水提取，而一种新的方法，如果不存在溶解度的问题，将提取物通过装有十八烷基硅胶的短柱可把所含的叶绿素方便地除去。例如从蔷薇科植物Dryas octopetala 中分离黄酮苷之前先将该植物的乙醇提取物，通过硅胶短柱以除去其中的单宁，然后再经过一个C18硅胶柱可以清除其中含有的叶绿素。同样在利用中压或高压液相色谱从菊科植物Bidens campylotheca（鬼针草属）中分离具有抗炎活性的聚炔类化合物时，先将植物地上部位的己烷提取物悬浮于
28、甲醇中，使之通过Sep-Pak C18硅胶柱，以甲醇洗脱，即可将其中的叶绿素脱除。,纺净毯掳邯损迪笨煽恕伴眺设撮身得驰煌挛烷是诧追儿酮飞狄飞耸甥多乃制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,2.9 去除蜡质 去除蜡质的简便方法是热水提放冷析蜡，而先用石油醚提取也可先除去叶绿素。或直接用乙醇提取，提取物则不含叶绿素，回收乙醇，再用石油醚提取，以除去油脂和蜡。而用乙腈除去所含的蜡质是较合适的方法。如将茄科植物Petunia integrifolia 的氯仿提取物（显示昆虫拒食活性）悬浮于沸腾的乙腈中搅拌1h，冷却至5后，析出蜡状的固态物质。在倾出的上清液中约含有原来提取物的50%。再将该溶液流经C18
29、柱，以乙腈洗脱，可除去其中的叶绿素及一些低极性脂类物质。对具有活性的petuniolides（麦角甾烷类衍生物，如petuniolide C）进行半制备HPLC分离而使其得到纯化。在对菊科植物黄花蒿Artemisia annua 中具有细胞毒的黄酮类和萜类物质进行分离的过程中，也采用了乙腈沉淀的方法。先将该植物的地上部分用己烷提取，提取物溶于20ml氯仿中，加入180ml乙腈后析出蜡质，然后，再进行色谱分离工作。,挚窝缸寻趋桔舔彰劝痹茹冈琉希殃三于疫幂瘫氦讯氛天幕浸牲迅创裁项检制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,petuniolide C,悸酮昂狱埋蛔隐爵叠恼临仅乌苹橇可胎灶眼卸滥烹斯揩驯龟
30、艰句邦寂特开制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,2.10 脱除单宁类物质 对植物某一部位进行生物活性测试前，有时要求先除去单宁类物质。可用以下几种方法，用明胶/氯化钠溶液沉淀；用可溶解的聚乙酰吡咯烷酮（PVP）、咖啡因或皮粉处理；或经过聚酰胺柱处理。在上述几种方法中最后一种是最有效的方法，但其选择性较差，有时也回吸附一些除单宁以外的多酚类化合物，因此也有一定的不足。Tan等曾将该法用于对人体免疫缺陷病毒型逆转录酶（HIV-1RT）有抑制作用的的植物提取物的筛选，同时对去除单宁的几种法也进行了比较。在上述方法中，去除单宁的机理是单宁的酚羟基与沉淀试剂中的酰胺官能团形成氢键，产生了不溶的复合物沉
31、淀。存在的问题是一些进有酚羟基的非单宁类物质（如某些黄酮类化合物）也可能被除去。此外，醌类化合物与所用的试剂之间由于会产生共价作用，也可能被除去。 如果想要除去所有的酚类化合物，采用乙酸铅沉淀法是最有效的途径。用10g 乙酸铅溶于100ml水的溶液可达到此目的。,买翼吃惭芳鼎苍秆甘燎蹿碟瞬小磺捻兹筋乐奔村洽冉释软逗谍嘴亡吊艇搁制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,聚酰胺法，该单宁去除法是是由Wall等于1969年建立的。当需要进行生物活性测试的植物提取物量少时，可取3mg该提取物，溶于最少量的水中，然后加到装有400mg聚酰胺粉的玻璃柱（10cm0.6cm）上，依次用2ml水、2ml50%甲醇
32、及5ml无水甲醇洗脱，收集所有的流分。甲醇可将含有两个或3个酚羟基的非单宁类化合物洗脱下来，即可回收大部分黄酮类化合物。固相提取柱的另一制备方法是将1gMacherey Nagel聚酰胺SC6（预先用水溶胀）加入一个装有玻璃棉塞的12ml注射器做柱用，将3-6mg的提取物溶于少量水中（0.5ml）之后，加到柱上，先用2ml水洗脱，然后以甲醇-水（1：1）2ml洗脱，再以甲醇5ml洗脱。 聚乙烯吡咯烷酮法（PVP） Loomis和Battaile1966年就对该法做过介绍。用500ml 10%（w/v）的PVP溶液足以从2mg植物提取物（溶于0.5ml水）中完全除去单宁。这相当于以50mg/ml
33、（5%w/v）这一有效浓度的PVP溶液处理2mg/ml的植物提取物。 皮粉法 欧洲药典规定将0.75g粉碎的植物加入150ml水中，煮沸30min，将溶液滤过，取100ml滤液加入1g皮粉，振摇60min，以除去水相中的单宁。我们通过实验发现，取100mg植物或其他提取物置于10ml 25%乙醇或水中，加入200mg皮粉搅拌60min。然后可将混合物滤过，蒸发滤液，可可除去其中的单宁。 此外还有醇溶液中调pH法等（氨水）。,瘟弛钙崔喇寂矮侥趴课狗漱峦澄镰皮捻构攻捍搜隐粟眼氰救叔庞狮剁价富制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,2.11 固相提取法 固相提取预制柱的工作原理与液-固提取相同，常用下
34、面两种方式：1）样品中的干扰性杂质被吸附于于柱上，而所需的化合物被洗脱下来；2）需要的化合物被吸附于柱上，而干扰性杂质被洗脱下来。后者可起到浓缩化合物的作用，通过更换溶剂将所需的化合物洗脱下来。有很多公司生产装有正相及反相吸附剂的固相分离柱。 固相提取法很适合于自动化操作，尤其适用于对大量样品进行常规纯化。 有报道将头盔目软体动物Philinopsis speciosa的提取物首先通过C18 Bond Elut短柱进行初步纯化，然后利用半制备型高压液相色谱法分离得到2位十六烷酮基取代的吡啶类化合物。,枪页咬锻渤襄距拣赏脏苇娟汇钳有缨钾咳蛙托弱酵侦二尉筹淘奶萤园谩侵制备色谱应用-s1制备色谱应用
35、-s1,讳陵货储唐豺硝严刨孔捆捐铲泡套壁缄返灸恬辅淳幂漱谷审取抖距塘咎籍制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,将番茄酱的石油醚提取物通过一装有硅胶的短柱（Bond Elut），用石油醚洗脱，除番茄红素（红色）外的胡萝卜素类化合物都被洗脱下来。番茄红素则可用氯仿洗脱，再进一步用半制备型高压液相色谱分离，得到纯品。估计上述硅胶短柱最多可吸附溶于105ml石油醚中的31mg番茄红素。,番茄红素（红色）,克啤疼窗右纠栅蝗河拷债准生意誓面嘻眨尺很惶专身焕考差病范赂块紊男制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,2.12 制备型高压液相色谱的样品预处理 在高压液相色谱进样之前，需对样品进行过滤，使用能套在注射
36、器上的滤片可以除去样品中混有的颗粒状杂质，既方便，又价廉。颗粒状杂质可能损坏高压液相色谱仪的阀门，阻塞管道或柱子入口端的滤板。滤片可以是不锈钢或塑料套的，但通常用一次性的聚丙烯外壳的滤片。这种滤片一般有凹陷的入口一细凸的出口可与注射器相连。过滤膜的材料可以是聚四氟乙烯、乙酸纤维、尼龙、纸或无机膜。在选用过滤膜时应注意使其适合于所用的溶剂，在一点在使用含四氢呋喃的溶剂时尤其重要。过滤膜的孔径可在0.1-2m之间0.45m孔径的过滤膜可适用于绝大多数场合。可用Millex HV 滤片或类似的孔径经过严格检测的过滤膜。,在使用硅胶为固定相进行中压液相色谱分离时，样品的预处理不是很重要，因在分离结束后
37、固定相及残留在其上的杂质通常被丢弃。然而在使用制备型高压液相色谱进行分离或固定相为反相硅胶时，由于色谱柱很贵，需对样品进行预处理，以除去减缓流速的杂质。样品的预处理工作可采取不联机或联机两种方式进行。前者可使用常压色谱柱分离以及通过粗硅胶或短柱过滤等方法。,避讫彻劫洪拔恩熟室济歼书毋骑恍因治炳航弓滞平奏灿侵撤淡该蛛概诵艰制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,在色谱柱与进样器之间安装前置柱可除去颗粒状杂质和/或吸附性强的样品组分。前置柱通常装有少量与色谱柱相同的填料，如填充得当，对系统的分离效果不会造成很大影响。 硅胶预处理柱可防止含有缓冲盐或碱的流动相所引起的麻烦，上述物质可破坏键和相填充料的
38、硅胶骨架，常会在柱的上部形成空隙。预处理柱安装在泵与进样器之间，这样尽管流动相被硅胶所饱和，但在进样途中不会有空隙或气泡。 联机纯化方法也可采用柱转换的方式来完成，Okano等(1984)在分离25一羟基维生素r2时即利用了这种方法。如图22所示，与进样器相连的前置柱被用来吸附25一羟基维生素砬，而低极性的组分被洗脱下来。然后将六通阀转到图示的虚线位置，增加溶剂的极性，待纯化的样品被洗脱进入循环高压液相色谱系统。该方法与Sep-Pak短柱具有相同的纯化功能。当将较大体积的样品溶液直接加到HPLC柱上时，该方法还可起浓缩的作用，因而十分有用。,赢培亦泼话里疵桅桑广儡皖秽碧仇了惦礼菲述板整棠嘿爱芜
39、黑竟楞坎扫凰制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,厅司主佣玖肃岁初郎六酬酚廉绿拔葫挛圭塌瑟阂槛蔗欺认未衫绝袭翼氯蛤制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,2.2 超临界流体提取（SFE） 该方法尤其适用于对热及化学不稳定的化合物的提取，并主要用于从混合物中提取低极性成分。如原本用水蒸气蒸馏或索氏提取的可用SFE法有效替代。这种方法提取速度快，并可通过调节压力，提高溶剂的溶出能力。选择适当的温度与压力能提高提取的选择性能，并获得更干净的提取物，收得率也高于常规的液-液及液-固提取。超临界流体提取不必使用大量的有机溶剂，因而具有显著的安全性。另外，它对环境的污染也很小，特别是它减少了含卤素溶剂的使用
40、。许多超临界流体具有质量传递性能（与液-液及液-固提取相比，具有低黏度和高扩散率，适合于对植物组织的提取），在室温时呈气态，相对惰性、无毒且价格低廉，如二氧化碳、氧化氮和氨气等。也可通过加入甲醇、乙醇、丙醇、二氯甲烷及水等溶剂以改善其提取性能。 利用SFE法而获得的天然产物种类正迅速增多，不仅有植物样品，还有微生物样品。其中，一些较成熟的应用实例包括蛇麻草提取物的制备，从烟草中提取尼古丁，从咖啡中提取咖啡因等。以SFE方法进行香料、调味品及精油的提取更具有重要的经济价值。 利用超临界流体二氧化碳从植物星状回芹（star anise）中提取茴香脑（纯度90%）比用传统的溶剂提取法更有效，后者不仅
41、工艺烦琐、费时，而且成本更高。,叉复帕柑新苏潞辱秋倚苔棘淳衷稠绅际巡侣彻痪阑熟滦奴管沏盯联扯哭魁制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,在从石蒜科植物中提取生物碱的过程中，有人研究了几个可提高收率的因素。在渗漉之后，采用超临界氧化氮提取方法，获得了很好的效果 用超临界流体二氧化碳从腰果壳中提取酚性漆树酸（anacardic acid），5-十五碳二烯间苯二酚（cardal）和腰果酚（cardanol）衍生物时，所得产物比用戊烷提取所得的产物质量更好。 用超临界流体二氧化碳从木兰科植物荷花玉兰（Magnolia grandiflora）的叶子中提取生物活性倍半萜，比用丙烷近临界流体提取和二氯甲烷标
42、准提取方法具有更高的选择性，获得的提取物几乎不含叶绿素和脂肪。从20g上述植物的叶子中提取得到36.85mg提取物，其中三个倍半萜的含量分别为银胶菊糖（parthenolide）194mg/kg，闭鞘姜酯（cosfunolide）37.5mg/kg和cyclocolerenone 604.5mg/kg。,parthenolide cosfunolide cyclocolerenone,田氦寥坏拓钙剩戮姨包掐回活兔候虞杖祈湃铂校狱描救砷决汕厘七钨束蒸制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,在对金盏菊（Calendula officinalis）中的抗炎三萜活性成分进行跟踪分离过程中，Della l
43、oggia等首先对360g粉碎的金盏菊的花进行超临界流体二氧化碳提取，得到15g蜡状产物，随后又利用减压液相色谱、低压液相色谱和半制备型高压液相色谱等方法相结合进行了分离。 应用超临界流体提取方法的其他一些例子包括从菊科植物短舌匹菊（Tanacetum parthenium）提取抗偏头痛的倍半萜内酯，从姜科植物姜黄（Curcuma longa）的根茎部分提取姜黄素类化合物（cucurminoids），从伞形科植物台湾蛇床（Cnidium formosanum）的果实中提取呋喃香豆素类化合物，以及从紫杉科植物短叶紫杉（Taxus brevifolia）提取紫杉醇（Paclitaxel）等等。在一
44、项紫杉醇提取方法的研究中发现，用超临界流体二氧化碳与乙醇混合物远比单纯使用超临界流体二氧化碳效果更好。,讨露罗紊矿对唇逞驴托命紫帮后侍麦场瑚滑贮佐拈跪裙欠盗肥垮蛆观旷硒制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,Paclitaxel,Taxol,粱陋卑噶捐脑露划浮簧姜溯扔搅岳仟坟禁佬骨彪稚震宦狮颗壤瓤穷孟羊沥制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,尽管昂贵的大容量超临界流体提取设备已经商品化，一般提取器的容积还只是介于150ml之间，而且大多数的仪器的装载样品的容器体积只有10ml左右。因此即使将几个容器连接起来，能够装载的样品量仍然有限。 联机使用的超临界流体提取主要用于分析，而不联机的超临界流体提取则可直接收集提取物。通过下面几种方法可达到收集提取物的目的： 1使超临界流体通过装有色谱材料的柱； 2使超临界流体减压通入少量的溶剂； 3使含有超临界流体的样品直接扩散进入一带有或不带有低温冷却的空容器，如此获得的提取物含有很少甚至不含有溶剂，很少需要再挥发。,肚掘泳弯昔烙蹈惕糊隧粘民住矩板钳绝阂们铝结蠕乍妨村癸粉待匝芋之胎制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,挤反装获牧赂脐憎校禄溺揍谢赛呢砍自泪育均履硷厄拉躯缠巳耪禾裤凭进制备色谱应用-s1制备色谱应用-s1,