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1、1株绵羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及致病性研究溶血性曼氏?U菌（Mannheimia haemolytica，Mh）别称溶血性巴氏杆菌，该菌属于机会致病菌，可长期寄生于牛、绵羊、山羊等反刍动物及其他动物上呼吸道1-2。当受到外界环境骤变、长途运输等刺激出现应激反应，动物机体抵抗力下降，病菌可趁机侵入从而致病，病毒和支原体感染如绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、副流感病毒等，可使得机体对溶血性曼氏杆菌更易感3-4。它能够引起牛、羊肺炎，新生羔羊的急性败血症，给养牛业和养羊业带来较大的经济损失5。 2015年底，安徽宣城某养羊场发生疫情，死亡率达10%以上，发病羊主要表现为咳嗽、喘气、流鼻涕等呼吸道症
2、状，剖检病变主要为肺脏出血、充血、水肿、实变。从发病羊肺脏中分离出1株菌株，通过生化鉴定和PCR鉴定，确定该分离株为溶血性曼氏杆菌。 1材料与方法 1.1主要试剂 绵羊鲜血琼脂培养基、微量生化反应管、抗菌药物药敏纸片均购自浙江杭州微生物试剂公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker等均购自北京全氏金生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。 1.2试验动物 68周龄BALB/c小鼠，购自扬州大学比较医学中心。 1.3病原的分离 无菌采集绵羊肺脏组织块接种于鲜血琼脂平板上，培养24 h后，挑取单个菌落进行纯化。挑取纯化的菌落涂片进行革兰氏染色镜检。 1.4生化试验 将纯化的菌落按
3、照常规方法接种于葡萄糖、麦芽糖、甘露醇等生化鉴定管中，置于37 恒温培养箱中培养，观察其生化特性。 1.5PCR鉴定 参照Alexander等基于lkt基因设计的溶血性曼氏杆菌特异性引物（LktF：5-GCAGGAGGTGATTATTAAAGTGG-3；LktR：CAGCAGTTATTGTCATACCTGAAC）4进行PCR扩增，预期扩增片段大小为206 bp。 以纯培养细菌的染色体DNA为模板，PCR反应体系为25 L：Taq DNA聚合酶0.5 L，DNA模板2 L，引物P1、P2各1 L，10PCR buffer 2.5 L，dNTPs 1 L，无菌水18 L。反应程序：94 5 min
4、；94 30 s，60 30 s，72 30 s，35个循环；72 10 min。反应结束后取PCR产物于1.2%的琼脂糖凝胶中电泳检测。将目的片段切胶回收，并与pMD19-T载体连接，转化DH5感受态细胞，经鉴定正确后送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。1.6耐药性试验 采用纸片扩散法进行药敏试验，将分离的溶血性曼氏杆菌均匀涂布于鲜血琼脂平板上，然后将药敏纸片紧贴于琼脂表面，37 培养24 h，测量抑菌圈直径。 1.7小鼠致病性试验 将分离纯化的菌株接种于含犊牛血清的LB液体培养基中，37 培养24 h，取菌液10倍系列稀释，进行活菌平板计数。取小鼠30只，随机分为6组，将计数后的菌液进行腹腔
5、注射，菌液（108、107、106、105、104 CFU/mL）0.2 mL/只，测定其致病性。对照组注射等量的培养基。对死亡小鼠进行剖检，观察组织病变，同时采集肺、脾、肝进行细菌分离培养。 2结果与分析 2.1细菌的分离培养 病原菌在绵羊鲜血琼脂平板上培养24 h后，形成圆形、光滑、湿润、半透明、不溶血的小菌落。革兰氏染色呈短小、多个的阴性菌（图1）。 2.2生化鉴定 该菌可发酵葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，不发酵乳糖、吲哚、甘露糖，符合曼氏杆菌生化特性。 2.3PCR鉴定 将分离的病原菌进行PCR扩增，得到与预期结果相符合的206 bp的特异性核酸片段（图2）。测序结果表
6、明，该分离株与GenBank中登录的AF314503、M24179、M20730、AF314512、AF314520、AF314522、AS314519、AF314518、AY425280、AF314517、AF314521、AF314506同源性较高，均在94%以上。进化树分析发现，该毒株与AF314503、M24179、M20730亲缘关系最近，共同组成1组微小分支（图3）。 2.4药敏试验 对分离到的菌株进行药敏试验，结果表明，该细菌仅对庆大霉素和头孢噻肟高度敏感；对链霉素、阿奇霉素、头孢曲松和氨苄西林中度敏感；对青霉素、四环素、红霉素、利福平、卡那霉素、恩诺沙星和大观霉素不敏感（表1）
7、。 2.5致病性试验 过夜培养的细菌经平板计数，菌液细菌数为1109 CFU/mL，取菌液10倍系列稀释腹腔接种小鼠，6 h后108 、107 CFU/mL 剂量组均有不同程度的发病，12 h后除105 、104 CFU/mL组外均出现死亡，对照组小鼠未见异常（表2）。因此，该分离菌对68周龄BALB/c小鼠的LD50为106.2 CFU/mL。 表2不同稀释度溶血性曼氏杆菌的致病性试验 试验动物不同稀释度的致死数10102103104105LD50 （CFU/mL）试验鼠5/55/53/50/50/5106.2 3讨论 溶血性曼氏杆菌是牛和羊鼻咽部的共生菌，主要引起肺炎、新生羔羊败血症、羊乳
8、腺炎等，也是犊牛“船运热”的主要病原。目前，该病原流行较广，Shanthalingam等从40份发病羊肺脏中分离到8株溶血性曼氏杆菌6；冯旭飞等对四川地区临床采集的120份肺组织和鼻拭子进行检测，结果检出率达51.67%7；李娟等、徐慧等和李雪霞等分别证实了该病原在江苏、新疆和云南地区的流行5，9-10。 本研究从发病羊肺脏中分离并纯化细菌，经菌落形态、生化特征和PCR鉴定，最终确定其为溶血性曼氏杆菌。综合临床症状、染色镜检可以有效缩小病原菌范围，结合PCR和测序鉴定，能够更加准确地确定该病原。致病性结果表明，108、107 CFU/mL剂量组感染小白鼠后，6 h出现不同程度发病症状，表现为精
9、神沉郁、食欲废绝等，12 h相继出现死亡，而对照组未见异常。死亡小鼠的剖检病变为肺脏充血，肝脏和脾脏肿大等，从死亡小鼠脏器中分离出与感染菌株形态特征一致的菌株。 抗生素的使用是养殖户预防和治疗疾病的重要手段，细菌的耐药性是困扰养殖户的一大难题。本研究的试验结果表明，溶血性曼氏杆菌对庆大霉素和头孢噻肟高度敏感；对青霉素、四环素、红霉素、利福平、卡那霉素、恩诺沙星和大观霉素等药物产生了耐药性，与冯旭飞等6、Katsuda等11和 Lubbers 等12报道不尽相同，说明不同地域分离株耐药性存在一定差异。该试验结果也为发病羊群正确合理用药提供参考。 目前，疫苗免疫是控制溶血性曼氏杆菌病的重要措施之一，由于各血清型之间交叉免疫保护性较低，疫苗的免疫谱窄，以至于本病未能得到有效的控制。因此，有待于研发预防溶血性曼氏杆菌病更佳的疫苗13-14。