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1、HDAC6在ISO诱导大鼠心肌纤维化中的作用研究1.2.4 HE和Masson染色以及心肌CVF计算：将切片经烤热后于二甲苯和梯度乙醇溶液中脱蜡至水。更换溶液，再重复上述步骤；苏木精染5min，流水冲洗；1%盐酸乙醇快速分化，流水稍洗，促蓝液返蓝数秒，流水冲洗；然后依次行HE染色和Masson染色。固定切片，光学显微镜下观察、摄片。在每张Masson染色切片中，挑取出3个非血管视野（400），使用图像扫描软件Image Proplus6.0进行扫描分析；计算CVF（%）：胶原面积/总视野面积100%。 1.2.5 I型及III型胶原含量的检测：血标本取出后，提取血清；依照ELISA试剂盒操作指
2、南进行：包被、加样、加酶标抗体、加底物液显色、终止反应、结果判定。分析并酶标仪测定I型III型胶原的含量，绘制标准曲线，计算胶原蛋白含量 1.2.6 HDAC6和-SMA蛋白表达测定：心肌总蛋白的提取：取出0.1g心肌组织块，均浆机充分打散并研磨成均匀糊状，置入离心管中；给予RIPA容液1毫升，放置冰上裂解30min、4离心机12000转/min，40min；管中提其上清液，测蛋白浓度，变性后于-80冰柜中保存留用；蛋白质电泳：采用常规凝胶电泳系统；免疫印迹杂交：200mA恒流电转印1h。PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBST封闭1h，一抗工作液，4摇床过夜。洗膜，二抗工作液，37孵育1h，洗
3、膜；显影：将A和B发光液按等体积混合；滴于PVDF膜上，压片，曝光，定影；采用Lab Works 4.5图像获取和分析系统软件测定蛋白条带的积分光密度，以-肌动蛋白作为参考的成像重复3次。 1.2.7 HDAC6、-SMA mRNA表达：RNA提取：用核酸提取剂测定心肌细胞中总核糖核酸，测定其核酸，以吸光值为计量，鉴定RNA的含量；反转录：以总RNA为模板，严格按照试剂盒说明，合成cDNA；PCR扩增：以-肌动蛋白作为内参照。依次由变性-退火-延伸三个基本反应步骤进行实时定量PCR扩增，引物序列如下（见表1）；电泳及结果测定：制作琼胶糖凝胶；取适量的PCR产物，加上样缓冲液充分混合，10V/c
4、m电泳4560min，成像系统成像分析，引物序列如下。 1.3统计学处理 以SPSS 16.0完善数据处理，采用（xs）表示，P 目前已有很多相关研究证实HDAC6与多种肿瘤方面有着较高表达，通过与-SMA、泛素化等多种方式参与肿瘤的调控。HDAC6异常结合到特定的启动子区从而抑制正常功能基因的转录可能是恶性肿瘤发生的机制之一。目前为止，癌症的治疗已有着突破性的进展，其中HDAC6抑制剂的应用起到相当重要的作用。多种HDAC6抑制剂治疗肿瘤已进入临床试验阶段。然而HDAC6在这种研究肿瘤的道路中如火如荼，却在心肌纤维化中少有报道。在本文中通过构造大鼠心肌纤维化模型，从而探究出HDAC6在心肌纤维化中是有某种相关性，进而研究HDAC 6在心肌纤维化中的作用。Western blotting法和qRT-PCR技术均提示：与正常组相比，造模组中的HDAC 6和-SMA转录及翻译水平都有明显的上升。那心肌纤维化中HDAC6和-SMA是如何调控的呢，-SMA是否会直接影响心肌纤维化我们不从而知，这也是本实验的不足之处。本实验结果仅提示两者之间是一种关联现象，为之后心肌纤维化的深入研究提供基础。