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1、第十六章 细胞因子与黏附分子检测,郑晓群,目 录,第一节 概述 第二节 临床常用的测定方法 第三节 细胞因子与黏附分子测定的临床应用,第一节 概述,重点提示,细胞因子与黏附分子概念 细胞因子的作用特点 细胞因子的生物学功能 黏附分子的生物学功能,概念,细胞因子（cytokine） 是由免疫细胞及组织细胞表达并分泌的，在细胞间发挥相互调控作用的一类小分子蛋白质或多肽，通过与细胞表面相应受体的结合发挥生物学效应。,概念,黏附分子（adhesion molecules，AM） 是由细胞产生、介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互结合的分子，以受体-配体结合的形式发挥作用。,一、细胞因子及其受体的特性与功
2、能,白细胞介素（interleukin，IL） 干扰素（interferon，IFN） 集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF） 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF） 生长因子（growth factor，GF) 趋化因子（chemokine）,细胞因子的种类,一、细胞因子及其受体的特性与功能,低分子量的多肽或糖蛋白，大部分为单体，半衰期短。 具有高效性、多效性、重叠性、网络性、协同性和拮抗性。,细胞因子的特性,一、细胞因子及其受体的特性与功能,参与调控免疫细胞的发育、分化和功能。 参与调控机体的免疫应答。 参与体内免疫调节网络等
3、作用。,细胞因子生物学功能,一、细胞因子及其受体的特性与功能,细胞因子与相应受体结合后发挥效应。 由胞外区、跨膜区和胞内区三部分构成。 组织反应性：受体的分布及密度。 膜型受体与可溶型受体。,细胞因子受体的共同特性,二、黏附分子的特性与功能,选择素家族(selectin family ) 钙黏素家族(cadherin family) 整合素家族（integrin family) 免疫球蛋白超家族（Immunogolobulin superfamily,IgSF),分 类,二、黏附分子的特性与功能,缺少跨膜和胞内部分，分子量小。 可直接分泌到血液和其他体液。 具有黏附分子的结合活性。 其水平的增
4、高程度与疾病相关： 脓毒血症：可溶性E-选择素，升高20倍23倍。 HIV感染：可溶性L-选择素，升高2倍3倍。,可溶型黏附分子,二、黏附分子的特性与功能,参与免疫细胞的分化和发育 参与免疫应答和炎症反应 参与伤口愈合、血栓形成 淋巴细胞的归巢 参与调节细胞凋亡,生物学功能,第二节 临床常用的测定方法,重点提示,基本方法 方法学评价 注意事项,检测水平,基因水平：分子生物学法,蛋白水平,活性：生物学方法,含量：免疫学测定法,一、酶联免疫吸附试验,夹心法ELISA：一步法和两步法 单克隆抗体或多克隆抗体 用于细胞因子检测 可溶型细胞因子受体或黏附分子检测 首选方法,基本方法,一、酶联免疫吸附试验
5、,特异、简便 成本低、易于推广 可大批量同时检测且废弃物便于处理 敏感性偏低 不能判断细胞因子的生物学活性,优 点,缺 点,一、酶联免疫吸附试验,检测标本：建议采用血浆（肝素或EDTA抗凝血） 检测条件：适时、适当刺激剂、检测时点 干扰因素：标本严重溶血、污染、分泌与降解,注意事项,二、化学发光酶免疫试验,CLEIA：双抗体夹心法 自动化分析 体液中细胞因子或可溶型细胞因子受体的定量,基本方法,二、化学发光酶免疫试验,特异性好、灵敏度高、线性范围宽 试剂稳定，可自动化检测 缺点是不能区分细胞因子的生物学活性,方法学评价,三、流式细胞术,基于荧光抗体染色技术并利用流式细胞仪高分辨力所建立的方法。
6、 单个细胞水平的检测。 用于细胞内细胞因子、细胞表面黏附分子和细胞因子受体的检测。,基本方法,三、流式细胞术,基本步骤,1分离和培养待检细胞 2细胞破膜与固定 3封闭非特异性结合位点 4染色与分析,三、流式细胞术,区分不同分泌特性的细胞亚群： Th1细胞 IFN- Th2细胞 IL-4 细胞表面的黏附分子或细胞因子受体： 直接或间接荧光抗体染色 无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭,三、流式细胞术,具有特异、高效、灵敏等特点，进行多参数相关分析接近生物体的分析条件，更准确反映体内状况。 缺点是流式细胞仪较昂贵，不易普及使用。,方法学评价,三、流式细胞术,标本处理：活细胞，保持良好状态 对照选
7、择：未刺激对照、激活对照、同型对照 荧光素选择： 低表达-PE、APC 高表达-FITC,注意事项,四、酶联免疫斑点实验,基本方法,ELISPOT 每个斑点代表单个分泌待测细胞因子的细胞。 斑点颜色深浅与细胞分泌细胞因子的含量相关。,四、酶联免疫斑点实验,优于传统分泌细胞的检测 类似于体内的实验环境 比常规ELISA 法的灵敏度高200 倍 引入生物素与亲合素放大系统，可大大提高灵敏度,方法学评价,四、酶联免疫斑点实验,选用的底物应在反应后形成不溶性产物 抗体：高亲和力、高特异性、低内毒素的特点 同时检测两种细胞因子，如IL-2 和IL-4 结核感染T细胞斑点试验,注意事项,五、免疫学测定方法
8、学评价,影响因素较少，特异性高 操作简便、快速，易于推广 大部分细胞因子均有商品化试剂盒，方便检测 重复性好，实验结果稳定,优 点,五、免疫学测定方法学评价,所测定的只是蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比。 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系。 敏感性相对较低，不如生物学测定法。 干扰测定：标本中可溶性受体，某些细胞因子结合蛋白或载体蛋白。,缺 点,第三节 细胞因子与黏附分子测定的临床应用,重点提示,临床应用原则 特定疾病的辅助诊断,一、临床应用原则,全身免疫或炎症状态：血浆或血清 细胞分泌细胞因子特性：外周血单个核细胞或相应细胞 炎症局部细胞因子的水平：局部分泌液 细胞内定位检测：相应
9、细胞 基因表达水平：相应细胞 疗效观察和预后判断：急性期和恢复期双份标本 细胞表面细胞因子受体或黏附分子：细胞活性或状态,标本的适当选取,一、临床应用原则,不同的检测目的，选择适宜的检测方法。 联合应用不同的检测方法，综合分析检验结果。 生物活性：生物学方法 基因水平：实时RT-PCR 细胞内的细胞因子：FCM,方法的联合应用,一、临床应用原则,复杂的免疫调节或效应网络系统 单一检测：不能提供有效的疾病信息 联合检测，综合分析,项目的联合检测,二、特定疾病的辅助诊断,细胞因子风暴 变态反应性疾病 自身免疫病 免疫缺陷病 器官移植排斥反应 恶性肿瘤,细胞因子与疾病,二、特定疾病的辅助诊断,动脉粥
10、样硬化 肾脏疾病 肝脏疾病 自身免疫病,黏附分子与疾病,三、评估机体的免疫状态,机体免疫应答的强弱，可通过细胞因子或黏附分子的表达水平来反映。 当疾病好转或恢复时，其免疫状态调整，细胞因子或黏附分子也恢复正常。,四、疾病疗效监测及指导用药,人工重组细胞因子的应用 选择细胞因子的种类及剂量 疾病疗效监测 细胞因子拮抗剂或抗体应用,本章小结,细胞因子与黏附分子是构成免疫应答的重要物质基础，检测这些分子可反映机体的免疫状态。 免疫学测定法是细胞因子与黏附分子常用的检测方法，包括酶联免疫吸附试验、化学发光酶免疫试验、流式细胞术和酶联免疫斑点实验。,本章小结,免疫学测定法检测的是细胞因子或黏附分子的蛋白含量，具有特异性高、操作简便、重复性好，实验结果稳定，测定影响因素较少等特点。 细胞因子与黏附分子的测定应结合检测标本、检测方法及联合检测做出综合考虑，主要用于：特定疾病的辅助诊断；机体免疫状态的评估；疾病疗效的监测和指导用药。,Thank you !,