动物细胞培养制药工艺-精选文档.ppt

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1、,动物细胞培养的应用,动物细胞培养制药工艺,17.1 制药动物细胞的表达系统与特征 17.2 基因工程动物细胞系的构建 17.3 动物细胞培养基的制备 17.4 动物细胞培养技术 17.5 培养过程检测与工艺控制,17.1制药动物细胞的表达系统与特征,一、动物细胞的结构与功能 二、制药动物细胞的种类 三、生产用细胞系 四、动物细胞的生产特征,17.1制药动物细胞的表达系统与特征,1.动物细胞的结构与功能,2、动物细胞培养的代谢特征,葡萄糖和谷氨酰胺：能量和合成代谢的前体。 葡萄糖限制:通过增加谷氨酰胺消耗得以补偿，反之亦然。 葡萄糖代谢：糖酵解为主，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中

2、积累。另一条途径为TCA循环，彻底氧化产生CO2和水。一小部分为戊糖磷酸途径，生成4、5、7碳糖和NADPH。 中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。 葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，对细胞有毒性。,三羧酸循环,2、动物细胞培养的代谢特征,谷氨酰胺代谢：脱氨、转氨等，合成其他非必需氨基酸。 脱氨作用：生成谷氨酸，脱氨产生的氨，对细胞有毒性。 转氨作用：生成嘧啶，嘌呤，氨基糖等合成代谢前体。谷氨酰胺与丙酮酸发生转氨作用，生成丙氨酸，进入培养液并积累。 离体动物细胞，转氨是主要代谢途径； Gln是动物细胞的氮源，Gln受限制时，通过增加其他氨基酸的消耗得以补偿。 流加葡萄糖或谷氨酰胺，控制整

3、个代谢过程，避免有毒废物的积累。,蛋白质合成场所：粗糙内质网上的核糖体，以 mRNA为模板，进行密码的翻译。,3、蛋白质合成，糖基化修饰和分泌表达,蛋白质糖基化修饰,糖基化场所：粗糙内质网腔内和高尔基体，加工修饰形成糖基化蛋白质，糖基结构易变化。 不同细胞系糖基化特征不同，根据药物的结构，选择适宜细胞系。,糖基化改造是研究热点。,糖基化蛋白质分泌,分泌泡与细胞膜融合，把产物释放到胞外，完成了蛋白质的分泌表达。,细胞周期：细胞从分裂开始到分裂结束的一段时间。 一个细胞分裂，形成两个细胞。1224h。,4、细胞周期与凋亡,四个阶段： M期：分裂期，很短，0.51 h 分裂间期 G1 S G2 期。

4、 G1期：DNA 复制前期,差异大 S期：DNA 合成期，68 h G2期：DNA 复制后期，25 h,细胞死亡的两种方式： 坏死：环境因素或病原物入侵，细胞受到严重伤害时快速膨胀，染色质凝聚而死亡，细胞直接裂解。 特征是坏死过程不受细胞自主控制。 细胞凋亡：细胞对环境变化作出的有计划的、执行预定程序的死亡应答过程。特征是细胞收缩，细胞核和DNA断裂，同时被膜包裹形成凋亡小体。,4、细胞周期与凋亡,显微镜下凋亡的细胞形态,反应器中的死亡形式主要是凋亡 不同细胞凋亡发生不同 原因：缺乏生长因子或血清、营养受限和逆境等均可引发凋亡发生。 细胞培养中需严格控制条件，防止细胞凋亡。,5、制药动物细胞表

5、达系统 5.1 哺乳动物细胞表达系统 5.2 昆虫表达系统,基于细胞来源：原代细胞，传代细胞。 基于细胞寿命：有限细胞系，无限细胞系。 基于细胞的染色体数目：二倍体细胞系，异倍体细胞系。 基于获得方式：工程细胞系，癌变细胞系。 基于生长特性：贴壁依赖型，非贴壁依赖型,5.1 哺乳动物细胞表达系统 1、细胞系的分类,概念：是生长和寿命有限的细胞，经过若干传代培养后失去增殖能力，老化死亡。 特点：有限生长（时间），有接触抑制性（密度）。 举例： WI-38、MRC-5、2BS等用于药品生产，曾经广泛应用，但不是理想的生产细胞系。 寿命：取决于细胞来源的物种和年龄、器官。人细胞最高培养次数为5060

6、代。 胚成纤维细胞：人，50代；鸡胚，30代；小鼠，8代。,（1）有限细胞系,概念：细胞在生长基质上分裂增殖，逐渐汇集成片，当每个细胞与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖。 特点：保持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加。 大多数细胞：形成单层细胞，有 少数悬浮培养细胞（癌细胞）：无,接触抑制,（2）无限细胞系,概念是寿命和活性不受传代次数影响的细胞系，可连续培养。 也称为永久细胞系或连续细胞系。 其特点：永生，没有接触抑制现象，对培养条件和营养因子等要求较低，倍增时间短，非常适合于制药工业生产。,动物细胞制药,表达系统,（3）工程细胞系,采用基因工程技术对宿主细胞的遗产物

7、质进行了修饰改造，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。 方法：融合或重组,Namalwa：类淋巴母细胞，悬浮生长。英国Wellcome公司Sendai病毒诱导，大规模生产干扰素，批准上市。产品逐渐淘汰。 WI-38：Wistar Institute（WI），二倍体成纤维细胞系，寿命有限。贴壁生长，对很多病毒敏感，第一个被用于制备疫苗。 MRC-5：二倍体成纤维细胞系，生长较WI-38快，对逆境有一定抗性，用于制备疫苗。,2、生产用细胞系,（1）人源细胞系,CHO细胞：Chinese hamster ovary 特点：贴壁型生长，也可悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。 最为普遍和成熟表

8、达糖基化蛋白药物的细胞。多种衍生突变株，高表达。 药物：EPO、HBsAg、G-CSF、凝血因子、DNA酶I,（2）哺乳动物细胞系,BHK21：baby hamster kidney， 成纤维样细胞，用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。上市重组凝血因子。 Vero细胞系：非洲绿猴肾的成纤维细胞，多倍体核型，贴壁依赖性。Vero E6最为常用，可增殖多种病毒，生产疫苗。,（2）哺乳动物细胞系,是脾脏B细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞 特点：无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生长，大量分泌和高效表达。 应用：抗体药物生产。,（3）杂交瘤细胞系,昆虫杆状病毒科核多角体病毒（载体）携载外源基因，感染昆虫

9、细胞或幼虫（宿主），高水平表达外源蛋白质。 1983：苜蓿尺蠖核多角体病毒秋黏虫细胞表达系统 1984：家蚕核多角体病毒家蚕幼虫表达系统。 应用：生产抗体、试剂盒等。日本批准用家蚕系统生产干扰素已上市。 常用的昆虫表达系统： Sf21：来源于秋粘虫的卵巢细胞。容易放大，高效表达。 Sf9：从SF21中分离得到，最常用。抗机械剪切，无血清培养基的搅拌反应器中生长。 TN-5B1-4：来源于粉纹夜蛾。表达能力高，能悬浮培养。,5.2 昆虫表达系统,家蚕完成基因组测序（西南大学完成） 优点： 安全：杆状病毒无致病性，产品安全性受FDA认可 易饲养：家蚕丧失了野外生存能力，饲养，发育快。 高量表达：强

10、启动子，外源基因可超量表达； 高效表达：可容纳较大的外源基因（12kb），表达数个外源基因，如抗体，并且装配成有功能的分子。 缺点： 翻译后的加工：昆虫细胞能进行一系列翻译后的加工，但与哺乳动物细胞不完全相同；蛋白质合成与加工不匹配，修饰效率可能不高，引起溶解性、稳定性、免疫性等变化。 重组率低，筛选困难，周期长，需要410d。,2、优点与不足,表达系统,对培养条件要求严格 对培养基组成要求高 天然结构与活性的药物,6.动物细胞的生产特征,对培养条件要求严格,1、温度,2、氧气,3、pH值,对培养基组成要求高,天然结构与活性的药物,生产工艺特征,17.2 基因工程动物细胞的构建,17.2.1

11、表达载体的设计与构建 17.2.2 转染与培养 17.2.3 筛选与鉴定,病毒载体： 牛痘病毒：构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒：肿瘤基因治疗 (重组人p53腺病毒注射液；5型腺病毒载体DNA和人p53肿瘤抑制基因重组；术中、术后使用可消灭残留癌)。 杆状病毒:外源基因表达（昆虫）。 质粒载体：穿梭载体，细菌体内扩增，在动物细胞中表达。 选择标记，扩增系统。,17.2.1 表达载体的设计与构建,1、载体类型,动物病毒启动子：SV40早期和晚期启动子、腺病毒晚期启动子、CMV立即早期基因启动子。 动物基因的启动子：高表达，延长因子EF-1启动子、泛素蛋白C启动子、IgG启动子。,2、 启动子与复

12、制子,启动子编码药物基因终止子，选择标记,终止密码子: T(U)AA, T(U)AG,T(U)GA PolyA信号序列：不宜太长，避免能量过度消耗。 常用:SV40 polyA(131)、BGH的polyA(225bp)。,3、终止子,表达载体结构举例,化学方法：磷酸钙，树脂，DEAE-葡聚糖 物理方法：基因枪，显微注射，电击穿孔 生物方法：病毒,17.2.2 转染与培养,转染：通过病毒载体把外源基因导入哺乳动物细胞的技术。,化学转染,磷酸钙转染,电击穿孔,物理转染,病毒载体的转染,病毒感染细胞的过程： 吸附，脱壳 核酸进入 进入细胞核 整合,DNA合成途径阻断标记，抗生素抗性标记：,筛选标记

13、与原理,小结与思考题,动物细胞培养制药,扩增培养：非选择性培养基，1-2d 筛选培养：选择性培养基,2-4d更换培养基，23周，获得单克隆细胞集落。 鉴定：对独立集落进行稳定性、表达量、生物活性等鉴定。 建库：按生物制品要求，建立细胞系和建库，妥善保存。,3、筛选与鉴定、建库,动物细胞培养基制备,培养基组成成分 培养基种类 培养基质量控制,动物细胞培养基制备,培养基组成成分,1、糖类,2、氨基酸,3、维生素,4、无机盐类,5、生长类因子与激素,动物细胞培养的种类,1、天然培养基,2、合成培养基,血清（Serum）成分与作用,血清（Serum）成分与作用,血清（Serum）成分与作用,2、合成培

14、养,3、无血清培养基,培养基质量的控制,1、培养用水质,2、缓冲液,Ca,Mg离子具有细胞凝集作用,3、生理盐水和平衡盐溶液,3、生理盐水和平衡盐溶液,4、氨基酸配制,5、NaHCO3配制,6、培养基灭菌,动物细胞培养技术,动物细胞培养技术,动物细胞生长和基质依赖性 动物细胞培养基本过程 动物细胞大规模培养方法,动物细胞生长和基质依赖性,1、生长基质,2、贴壁依赖性细胞,3、非贴壁依赖性细胞,4、兼性贴壁依赖性细胞,动物细胞培养基本过程,1、原代细胞培养 过程,2、传代细胞培养 过程,动物细胞大规模培养方法,1、单层贴壁培养 概念与过程,1、单层贴壁培养 特点,2、悬浮培养,3、微载体培养,4

15、、固定化培养,90年代以来, 医学界开始尝试以微胶囊作为基因重组细胞的免疫隔离和运载工具, 利用重组细胞的代谢产物调节机体生理功能, 治疗相关疾病。,微囊化人胰岛 培养15d,微囊化小牛肾上腺嗜铬细胞 培养0d,微囊化肝癌细胞 培养40d,不同放大倍数的海藻酸钙微胶囊的SEM 照片,不同放大倍数的壳聚糖/海藻酸钠微胶囊的SEM 照片,重组人红细胞生成素生产工艺,重组人红细胞生成素生产工艺,概述 细胞培养工艺 分离纯化工艺,概述,1、天然红细胞生成,2、EPO的理化性质,3、重组人红细胞生成素,4、rhEPO的表达研究,4、rhEPO的表达研究,CHO培养工艺,1、工程CHO细胞系,稳定转染的筛选培养,2、种子细胞制备,3、灌流培养,4、培养工艺过程控制,rhEPO的分离纯化工艺,1、初级分离,2、纯化精制,3、EPO的质控与活性检测,小 结,思考题,