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1、概述,在生物技术中，人们已广泛地围绕着细菌、酵母、丝状真菌等微生物的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质等产物。然而，许多有重要价值的蛋白质等生物物质，必须借助于动物细胞的培养来获得，例如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。 大规模的动物细胞培养开始于本世纪50年代，经过多年来的研究，人类对动物细胞培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大的进展。尽管如此，目前的技术水平还远不能满足细胞生物产品研究和生产的要求，随着动物细胞培养技术的应用日趋广泛，已显示出很广阔的发展前景。,基本概念： 动物细胞大规模培养技术：指在人工条件下，在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。 人工条件
2、-既满足培养过程必需的营养要求，还要进行pH和溶解氧的最佳控制,动物细胞培养的产物,大规模动物细胞培养工艺流程图,细胞培养反应器,提取,细胞,诱生剂,细胞,产品（肿瘤抗原）,纯化,产品（干扰素）,纯化,提取,产品（单克隆抗体）,浓缩纯化,7,9,8,6,5,4,3,2,1,10,1、动物细胞与微生物细胞的性质比较,第二节 大规模培养的方法和操作方式,2 、动物细胞与微生物细胞的培养方法比较,二、动物细胞培养方法,贴壁培养 悬浮培养 固定化培养,1.贴壁培养 是指必须贴附在固体介质表成上生长的细胞培养。,贴壁培养：,旋转瓶培养 中空纤维培养 细胞工厂培养 微载体培养,微载体悬浮培养系统,微载体培
3、养定义：用微珠作载体， 使单层动物细胞生长于微珠表面，可在培养液中进行悬浮培养。 微载体：贴壁培养动物细胞的载体微珠。 反应器:可用与悬浮培养相同设备,优点：比表面积大；生长条件易控制且易放大，兼贴壁与悬浮培养的优势，取样方便；易于分离。 缺点：连续搅拌损伤载体表面细胞；培养后期细胞容易脱落。,实心微载体大孔微载体,2. 悬浮培养 是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程。,6、悬浮培养的优点,增加培养细胞与培养液的接触面 及时带走培养物产生的有害代谢产物 保证了氧的充分供应,3.固定化培养 是既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式。,3、固定化培养,固定化培养是既适用于贴
4、壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式，具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点。 由于所培养的细胞的不同，固定化培养的方式也有不同，一般对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋，而对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。 常用的细胞固定化的方法主要有吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化等。,大规模培养技术的操作方式,（1）分批培养； （2）流加培养； （3）半连续培养； （4）连续培养； （5）灌流式培养。,1、分批式培养,定义,分批式培养是指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，同时产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。,在细胞分批培养
5、过程中，不向培养系统补加营养物质，而只向培养基通入氧，能够控制的参数只有PH、温度和通气量，因此细胞所处的生长环境随着营养物的消耗和产物、副产物的积累时刻都在发生变化，不能使细胞自始至终处于最优的条件下，因而分批培养并不是一种很好的培养方式。,营养物,废产物,PH、温度、DO,对数生长期,减速期,平稳期,衰退期,延滞期,为什么说采用分批式培养细胞效果不佳？,问题,细胞分批式培养的生长曲线如图所示。在分批式培养过程中，细胞的生长可分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期等五个阶段。,2、流加式培养（补料分批式）,定义,流加式培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件下接种细胞，进行
6、培养，使细胞不断生长，产物不断形成，而在此过程中随着营养物质的不断消耗，不断地向系统中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。,流加式培养只是向培养系统补加必要的营养成分，以维持营养物质的浓度不变。由于流加式培养能控制更多的环境参数，使得细胞生长和产物生成容易维持在优化状态。,流加式培养有何特点？（P102）,问题,PH、温度、DO,废产物,营养物,根据流加控制方式不同，有两种流加式培养方式：无反馈控制流加和有反馈控制流加。无反馈控制流加包括定流量加和间断流加等；有反馈控制流加一般是连续或间断地测定系统中限制性营养物质的浓度，并以此为控制指标来调节流加速率或流加液中
7、营养物质的浓度等。,3、半连续式培养,半连续式培养又可称为反复分批式培养，是指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并重新补充加入等量的新鲜培养基，从而使反应器内培养液的总体积保持不变的培养方式。,定义,4、连续式培养,连续式培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜的培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应器液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。,定义,与分批式培养和半连续式培养不同，连续式培养可以保持细胞所处的环境条件长时间地稳定，可以使细胞维持在优化的状态下，促进细胞的生长和产物的形成。由于连续式培养过程中连续不断地收获产物，并能提高细胞密度，在生
8、产上已被应用于培养非贴壁依赖性细胞。,请比较半连续式培养和连续式培养？,问题,细胞灌流式培养系统实例,液位控制,细 胞 悬 液,细 胞,新鲜培养基,收液,过滤器,细胞培养系统,动物细胞的连续培养一般是采用灌流培养。灌流培养是把细胞接种后进行培养，一方面连续向反应器中注入新鲜的培养基，同时又连续不断地取出等量的培养液，但是过程中不取出细胞，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态。当高密度培养动物细胞时，必须确保补充给细胞以足够的营养以及除去有素毒的代谢物。灌流培养时用新鲜的培养液进行灌注，可以确保上述目的的实现。通过调节灌注速度，可以把培养过程保持在稳定的、废代谢物低于抑制水平的状态下
9、。灌流培养过程的特征如图所示。,PH、温度、DO,废产物,营养物,不同培养方式对CHO细胞生产人组织血纤维溶酶原激活剂（tPA)产量和活性的影响,采用灌注培养的优越性不仅在于大大提高了细胞生长密度，而且有助于产物的表达和纯化。如表及图所示，因此，灌注培养已经应用于许多不同的培养系统中，规模已达几百升。,说说灌注培养的优越性？,问题,第三节 动物细胞生物反应器,1、通气搅拌式细胞培养反应器,工作原理:反应器运转时，圆筒以30-60r/min的速度转动，由于离心力的作用，搅拌器中心管内产生负压，使搅拌器外培养基流入中心管，沿管螺旋上升，再从导流筒口排出，从搅拌器外沿下降，形成循环流动。在气腔内气体
10、由分布管鼓泡，气体溶于液体中，依靠气腔丝网外液体的循环流动及扩散作用，使溶于液体中的气体成分均匀地分布到反应器内。,反应器的优缺点 优点：避免向培养基直接通气时气泡损伤细胞，没有移动部件，密封好，氧转换率较高，便于放大。 缺点：氧传递系数小，气路系统不能就地灭菌。,反应器适用范围 悬浮培养：非贴壁依赖性细胞和贴壁于微载体的贴壁细胞,2、气升式动物细胞培养反应器,与微生物发酵及植物细胞培养的反应器结构相同。,优点:器内湍流温和均匀剪应力小，完全密封，便于无菌操作，氧的转换率高，便于放大生产。,3、中空纤维细胞培养反应器,1）结构 2）用途 :培养悬浮生长的细胞和贴壁依赖性细胞,3)优点 培养器体积小，细胞密度高； 浓缩产品； 产物纯度高； 自动化程度高，细胞生长周期长。 4)缺点:价格高,