最新细胞学-第五章 动物组织与细胞培养-PPT文档.ppt

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1、一、 动物细胞培养的基本条件,无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器， 洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外 灯，电热干燥箱，高压灭菌器，抗生素 细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶， CO2培养箱，培养基，血清 细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪 ，微孔板震荡器，高 速离心机，移液器 细胞保存条件：液氮罐 实验室安全：生物实验室安全，P1,P2,P3实验室安全,第一节 动物组织和细胞培养的基础知识,(一) 无菌条件,净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，高压灭菌器，抗生素.,1 净化工作室,风淋室是生物洁净室的

2、理想配套设备，用于吹除进入洁净厂房的人、物表面附着的尘埃 是进行人身、物料净化和防止室外空气侵入洁净区的有效设备 风淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35较为适宜。,2 风淋室,风淋室:,该装置是一种洁净室的辅助设备，主要用于洁净区与洁净区，洁净区与非洁净区之间小件物品的传递，以减少洁净室的开门次数，把对洁净区的污染降低到最低程度。,3 传递窗:,传递窗,高效过滤器是用超细玻璃纤维纸作滤料，胶板纸作分隔板，可与铝合金框、木框及镀锌钢板框组合而成。 特点：具有低阻高效、轻质、容尘量大等特点， 适用于常温常压常湿条件下环境空气的净化.,4 高效过滤器:,层流罩是可提供

3、局部高洁净环境的空气净化设备。洁净层流罩是将空气经风机以一定的风压通过高效空气过滤器后，使洁净空气呈垂直气流送入工作区，从而保证了工作区内达到工艺所需的高洁净度。,5 洁净层流罩:,6 超净工作台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,超净工作台,一种既能使操作造成无菌、无尘的局部空气环境，保证检验、检测不受污染，又能保证被研究的对象（如病菌、细菌等）不外溢，保护周围环境及操作人员的安全隔离设备。 该设备可广泛应用于低、中等危险度的临床细菌学，病毒学、微生物学、组织培养、生物学及生命科学的研

4、究，加工、检验部门。,7 生物安全柜:,生物安全柜:,8 紫外灯 ：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒 。,9 电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒 。,滤 器,10. 蔡氏（ Zeiss）滤器：过滤除菌，滤器中的滤膜一般用0.20.3m孔径的微 孔滤膜。凡在高温或射线下易发生变性或失去功能的物质，如人工合成培养液、血清、消化 用胰酶等都须用滤器过滤除菌。,大容量高压灭菌器,全自动手提式灭菌器,(二) 细胞生长条件,纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶， CO2培养箱，培养基，血清,1自动双重纯水蒸馏器 2 纯水仪,反渗透,精滤、活性碳

5、吸附,3 标准型细胞培养板 （Tissue Culture Plates）,6孔，12孔，24孔，48孔，96孔,4 培养瓶,5 CO2培养箱,CO2培养箱主要由箱体结构件、温度控制系统和CO2浓度控制系统三部分组成。 CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。 再现活体环境对于温度、PH值CO2浓度、氧分压（O2浓度）、相对湿度等细胞生长关键的因素，,6 移液器,(三) 细胞检测条件：,倒置显微镜，酶标仪 ，微孔板震荡器，高速离心机，移液器,15,用于微生物、细胞、细菌、组织 培养、悬浮体、沉淀物等的观察，并可将此过程中的任一形态拍摄下来。,倒置显微镜,酶标仪 微孔板震荡器,2,3,通过自

6、动酶标仪计数来检测活细胞数量。,主要用于酶标板、细胞培养板(如6孔板、12孔板、24孔板、48孔、96 孔板等)等溶液的混匀或细胞的混匀。,4 高速离心机,(四) 培养细胞生长的条件,1 细胞的营养环境 2 细胞的生存环境 温度: 37 ，O2 CO2: 5%，CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 3 无污染 4 无毒,1 细胞培养用液的配制 1）水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 2）平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液，维持一定渗透压和pH PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20

7、加水至1000 ml,3）消化液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制,常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。,4）培养基：,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染,合成培养基：,合成培养

8、基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 。 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ； 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等； 各种生长因子； 转移蛋白； 不明成分。,一般说来，含5

9、小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加10血清 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子， 因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。,无血清培养基:在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 无血清细胞培养基优点保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。,血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛

10、血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌,补体是热敏性的，是机体免疫防御系统的重要组成部分，其主要功能是抗感染，补体虽然具备杀死病菌的作用，但有时也伤害好细胞，引起炎症的作用。,抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定。,基础培养基 80一95 血清 5一20 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100单位毫

11、升,完全培养基的组成,二 细胞培养基本技术,(一)无菌操作技术,体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。 即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。,(二)培养细胞的观察,肉眼观察培养物颜色及混浊度 倒置显微镜观察细胞生长状态,肉眼观察培养物,显微镜观察细胞计数,计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 血细胞计数器：手工计数细胞,任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。 总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力.,(三)培养细胞活力测定,方法： 1、将细胞悬液以0.5

12、ml加入试管中； 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2-3分钟； 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片； 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力； 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。,1台盼蓝法,四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝； MTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值；,2四唑盐（MTT）比色法,操作步骤： （

13、1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5 CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）； （2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时； （3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解； （4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。 (5)该法可以绘制细胞生长曲线。,细胞活力检测,微孔板扳荡器,培养板,酶标仪,(四)细胞冻存和复苏,细胞冷冻程序,简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳

14、将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12的速度，在40分钟内降至液氮表面温度，停30分钟后，直接投入液氮中。 标准程序： 当温度在-25以上时， 12/min 当温度达-25以下时， 510/min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中,液氮罐,-196 ,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是二甲亚砜(DMSO)，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性。 能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶。,细胞冻存方法,1预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液配好 2取对数

15、生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)； 3加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 于液氮中冷冻,细胞复苏方法,（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）； （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； （3）低速离心10分钟； （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,据英国每日快报、每日邮报、每日明星报22日报道，当英国萨里郡16岁女中学生艾玛戴维斯抱着她5个月大的小妹妹尼亚姆时，没有几个人知道这对年龄相差整整16岁的姐妹，竟然还是一对双胞胎。,艾玛51岁的父亲艾伦戴维

16、斯和46岁的母亲简戴维斯是在1981 年结的婚，简遭遇了一连串的不幸流产。 1989年，简接受了试管授精治疗，伦敦不孕诊所的专家从她体内取出了33枚卵子，与丈夫艾伦的精子进行人工授精，最后一共形成25枚冷冻受精胚胎。,1989年12月13日，戴维斯夫妇的第一个女儿艾玛诞生,2005年12月7日，女婴尼亚姆经由剖腹产健康地降临到了人世。,据悉，艾玛和尼亚姆是先后通过17年前的同一组冷冻胚胎孕育诞生的，5个月大的“时空扭曲双胞胎”妹妹尼亚姆更是打破了一个医学史纪录，因为此前世界上还没有哪个受精胚胎被冷冻了长达16年时间才孕育出生。,(五)细胞培养的污染和检测,细胞污染的种类可分成：细菌、酵母菌、霉

17、菌和病毒。,显微镜观察法,细菌,1.细菌和真菌的污染和检测,显微镜观察法,霉菌,2.支原体的污染和检测,造成支原体高污染率的原因： 1.支原体大小0.10.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）； 2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化,1)DNA荧光染色法 原理利用荧光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）检测支原体污染。此染剂会结合到DNA之A-T区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（5580%），所以可将其染色而检测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，

18、证明有支原体之污染。,支原体之检测：,2)PCR方法检测 原理： 利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S和23S rDNA序列，由于此段序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制之DNA来作侦测与鉴定。,支原体之检测：,PCR方法 支原体菌株来源：M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体, M.Fermentane ATCC19989发酵支原体 , M.Salivarium ATCC23064唾液支原体 ,M.Hominis ATCC23114人型支原

19、体 ,M.Orale ATCC23714口腔支原体 ,M.Hyorhinis ATCC29052猪鼻支原体。 其共同引物序列来自16s和23s保守区域： 外部引物为： 1 5-3， 1 5-3；,3. 病毒的污染和检测,电子显微镜观察;免疫学检查;PCR技术,三 培养细胞的生物学特征,洋蔥的表皮細胞,植物輸導水分的細胞,哺乳類的肌肉細胞,人類脊髓神經細胞,(一)体外培养细胞的分型,1 贴附型： 大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞. 有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面才能生存和生长,1)成纤维细胞型： 胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。,按照培养细

20、胞的主要形态，可分为几大类型,例 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮,成纤维细胞,细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。 如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。,2)上皮细胞：,上皮型细胞,3）游走细胞型： 呈散在生长，一般不连成片，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。如单核细胞 、嗜酸性粒细胞。,4）多型细胞型：,有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,2 悬浮型： 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖

21、。,(二)培养细胞的生长和增殖过程,1 培养细胞生命期（Life Span of Culture Cells） 所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。,1)原代培养（Primary Culture）期： 也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。 初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞相互依存性强。,2)传代期： 初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。 在全生命期中此期的持续时间最长。 在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型

22、的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。,为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。 当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。 一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。,3)衰退期： 此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。 在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。 转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）。,细胞永生性也称不死性，即细胞获

23、持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。 无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。 细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能永生性.,培养细胞生命期,衰退期,传代期,原代培养期,2 组织培养细胞一代生存期,所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞倍增Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。细胞传一代后，一般要

24、经过以下三个阶段：,请勿打瞌睡,1)潜伏期（Latent Phase）： 细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。 此时细胞胞质回缩，接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。 各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。,初代培养细胞贴附慢，可长达1024小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，1030分钟即可贴附。 支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。 另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素（Fibronectin），细胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也参

25、与贴附过程。 细胞接种密度大时潜伏期短。,细胞贴附,2)指数增生期（Logarithmic growth Phase）： 这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。一般以细胞分裂指数（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。 一般细胞的分裂指数介于0.1%0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%5%。,A 接触抑制：在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Conta

26、ct Inhibition）。 B 密度抑制：细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。,指数增生期会发生:,3)停滞期（Stagnate Phase）： 细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（Plateau）。 停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。 此时需做分离培养即传代，否

27、则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。,打磕睡是危险的,当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。,(三)体外培养细胞的种类,1初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。 一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。,2细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。 如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持

28、续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。 无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。,3细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。,4肿瘤细胞系或株 这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。,细胞系或细胞株的命名,HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌） CHO：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary） 宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立,细胞系或株的鉴定、管理和使用,ATCC入库细胞要求检测项目如下： 培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等 冻 存 液：培养基和防冻液名称 细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性 培 养 液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量,Thank You,The End,