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1、实验目的,1、通过对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义； 2、掌握小白鼠腹腔注射给药和颈椎脱臼处死方法。,实验原理,细胞吞噬作用原来是单细胞动物摄取营养物质的方法，也是原始防御作用。随着动物界的进化，在大多数高等动物体内，吞噬作用不再是细胞的进食方式，而是作为防御细菌、病毒、真菌、原生生物感染的保护机制而存在，此外，吞噬作用还能帮助多细胞动物清除受伤后形成的组织碎片和发育过程中的凋亡细胞。在高等动物体内，具有吞噬功能的细胞包括中性粒细胞、单核细胞或巨噬细胞，即大小两类吞噬细胞，专司吞噬作用，成为非特异性免疫功能的重要组成部分。,非特异性免疫功能是人类在
2、种系进化过程中形成的由遗传而获得的免疫防卫功能，它是先天就具备的。非特异免疫构成机体生存必不可少的抵抗外来病原体的第一道防线，它对病原体的识别不具有特异性，也无记忆。,实验原理,巨噬细胞由骨髓干细胞分化生成，然后进入血液到达各组织内，并进一步分化为各种巨噬细胞。他们是机体内吞噬能力最强的细胞。单核细胞和巨噬细胞都能消灭侵入机体的细胞，吞噬异物颗粒，消除体内衰老、损伤的细胞和变性的细胞间质、杀伤肿瘤。当病原微生物或其它异物侵入机体时，能招引巨噬细胞，而巨噬细胞又有趋化性，能响应招引因子的招引，产生活跃的变形运动，主动向病原体和异物移行，在接触到病原体或异物时，即伸出伪足，将之包围并内吞入胞质，形
3、成吞噬体，继而细胞质中的初级溶酶体与吞噬泡发生融合，形成吞噬性溶酶体，通过其中水解酶等作用下，将病原体杀死，消化分解，最后将不能消化的残渣排出细胞外。,参与非特异性免疫的单核细胞进入组织后，可分化成巨噬细胞，巨噬细胞分布广泛，由于其分布的器官组织不同，使巨噬细胞不仅具有不同的名称，而且在形态和功能上也表现异质性，如存在于胸腹腔的游离巨噬细胞，脾与淋巴结中的游走和固定的巨噬细胞，结缔组织中的组织细胞，肺泡中的尘细胞，肝组织中的枯氏细胞、神经组织中的小胶质细胞等，这些细胞都具有吞噬功能。,巨噬细胞是机体免疫应答的主要细胞之一，对实验动物巨噬细胞吞噬能力的测定，是其非特异免疫能力的检测的一项重要指标
4、，目前本实验在病理、免疫、肿瘤学研究领域仍然广泛使用。由于巨噬细胞含有大量的溶酶体、吞噬体和残余体，因此以台盼蓝、卡红染料注射到实验动物体内，可以见到巨噬细胞胞质内聚集很多蓝色、红色颗粒，而其他细胞则不摄取或仅少量摄取染料颗粒，因此常用该方法鉴别巨噬细胞和其他细胞。,巨噬细胞的生成,单核细胞（上）和巨噬细胞（下）,吞噬作用,吞噬作用,溶酶体的功能,巨噬细胞正在吞噬衰老的红细胞,巨噬细胞吞噬细菌（电镜）,实验用品,1.器材：显微镜，解剖盘，剪刀，镊子，离心机，注射器，吸管，玻片，吸水纸。 2.材料 ：小白鼠，1%鸡红细胞悬液（取无污染的鸡血1ml，放入盛有4ml Alsever溶液瓶中，混匀置4
5、冰箱保存备用，一周内使用。使用前加入0.85%生理盐水以1500r/min离心10min，洗涤两次，再用生理盐水配成1%浓度悬液。,抽取静脉血,试剂,3.试剂： （1）0.85%生理盐水 （2）Alsever溶液： 葡萄糖 2.05g 柠檬酸钠 0.89g 柠檬酸 0.05g 氯化钠 0.42g 蒸馏水 100ml 调PH值至7.2，过滤灭菌或高压灭菌10min，置4冰箱保存。,（3）0.4%台盼蓝(trypan blue)染液 台盼蓝染粉 0.4g 0.85%生理盐水 100ml （4）6%淀粉肉汤（含台盼蓝染液） 牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1.0g 氯化钠 0.5g 蒸馏水 100ml 加
6、热后加入可溶性淀粉6.0克，促使溶解，再煮沸灭菌，置4冰箱保存。用时水浴融化，加入适量台盼蓝染液混匀，使呈蓝色。,实验步骤,1、在实验前一天，给小白鼠腹腔注射6%的淀粉肉汤（含台盼蓝）1ml。 2、实验时，取一只注射过淀粉肉汤的小白鼠，腹腔注射1%的鸡红细胞悬液1ml，轻按小白鼠腹部，使悬液分散。 3、20min后，用颈椎脱臼法处死小白鼠（用右手抓住鼠尾，左手拿一把剪刀或镊子按住颈椎，右手用力向后拉即可）。,徒手抓小白鼠,给小白鼠腹腔注射给药,给小白鼠腹腔注射给药,实验步骤,4、将小白鼠置于解剖盘中，把腹部剪开一小口子，把内脏推向一侧，用吸管吸取适量的生理盐水冲洗腹腔，并吸取腹腔液，吸时一吸一
7、松，以免把内脏吸出。 5、每人取一张干净载玻片，滴一滴腹腔液，盖上盖玻片，置显微镜下观察。 6、每人取一张干净载玻片，滴一滴没有注射淀粉肉汤的腹腔液，盖上盖玻片，置显微镜下观察。,取腹腔液,观察与结果,由于细胞未经染色，因此观察时视野亮度需要适当调低。巨噬细胞体积较大，呈圆形或者不规则形，表面有伪足，胞质中含有数量不等、大小不一的蓝色颗粒，为淀粉颗粒被吞噬后形成的吞噬体。鸡红细胞为椭圆形、淡黄色，细胞核也为椭圆形。在显微镜下可以观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程：有的红细胞位于巨噬细胞的表面，有的被部分吞入，有的被完全吞入，形成吞噬泡。有的吞噬泡体积缩小、呈圆形，表明已与溶酶体发生融合，泡内物质正被消化分解。,巨噬细胞吞噬鸡红细胞过程,巨噬细胞吞噬鸡红细胞过程,巨噬细胞吞噬鸡红细胞过程,巨噬细胞吞噬鸡红细胞过程,巨噬细胞吞噬鸡红细胞过程,巨噬细胞吞噬鸡红细胞过程,吞噬了鸡红细胞的吞噬细胞,未被吞噬的鸡红细胞,思考题,1、在高倍镜下绘出在不同吞噬阶段的巨噬细胞图各一个（如鸡红细胞附于巨噬细胞表面、部分吞入红细胞、吞入后形成吞噬体等），示吞噬作用的过程。 2、实验前一天，给小白鼠腹腔注射含台盼蓝的淀粉肉汤的目的是什么？巨噬细胞内有哪几种结构对执行复杂的吞噬功能最重要？,下次实验：细胞核和线粒体的分级分离,