植物病毒病的诊断与鉴定-PPT文档.ppt

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1、植物病毒病的诊断与鉴定 植物病毒的形态、结构与组分 2 植物病毒病的概况 1 植物病毒的鉴定 4 植物病毒病的症状特点 3 植物病毒病的综合防治 5 1.植物病毒病的概况 病毒（Virus）是包被在蛋白或脂蛋白保护性衣壳中，只能在适 合的寄主细胞内完成自身复制的一个或多个基因组的核酸分子 ，又称分子寄生物。 病毒区别于其他生物的主要特征是： 1.病毒是个体微小的分子寄生物，其结构简单； 2.专性寄生物，其繁殖需要寄主提供原料和场所。 按寄主性的不同，病毒分为寄生植物的植物病毒(Plant Virus)、寄生动物的动物病毒以及寄生细菌的噬菌体等。 1.植物病毒病的概述 病毒引起的病害在数量上占植

2、物病害的第二位。由植物病毒引起 的植物病害的植物有：禾本科、茄科、豆科、十字花科和葫芦科 等。在辽宁省引起毁灭性的植物病毒病有番茄蕨叶病毒病，辣椒 花叶病毒病和烟草脉坏死病毒病等。 生产上危害较大的植物病毒病害有：烟草花叶病、黄瓜花叶病、 马铃薯病毒病、玉米矮花叶病等。 植物病毒也有可利用的价值，特别在开发基因工程的载体、转基 因植物研究等方面，发挥了很大的作用。 植物病毒的危害及作用 *4 1.植物病毒病的概述 植物病毒学研究历史： 1886年梅耶尔(Mayer)证明了烟草花叶病害的摩擦传染性; 1892年伊凡诺夫斯基(Ivanowski)发现了烟草花叶病的病原可以 通过细菌过滤器； 189

3、8年伯吉林克(Beijeincku)又发现该病原不是微生物，而是一 种传染性活液 ( contagium vivum fluidum )，这就是Virus一词的 来源； 1935年，美国科学家斯坦利（Stanley）获得了烟草花叶病毒的 蛋白结晶,认为病毒是可在活细胞内增殖的蛋白（1946年获 Nobel Prize in Chemistry)。 *5 1.植物病毒病的概述 植物病毒学研究历史： 1936年英国科学家鲍登(Bawden)证明提纯的TMV中含 有核酸； l939年Kausch通过电子显微镜观察到植物病毒的形态 ； 1956年Gierrer 证明去掉蛋白质的RNA起重要侵染和 繁殖

4、作用； 1971年Diener 发现了很小的RNA（250-400bps)称为类 病毒（viroid); 1982年发现仅有蛋白质的月元病毒 * *6 1.植物病毒病的概述 植物病毒学研究历史： 1981年，A.Lwoff在巴黎举行的第五届病毒学大会上，这一法国病毒研究所 所长阿尔沃夫，认为病毒不是生物，他的观点如下： 生长和分裂 独立进化 独立的生命体 活的 原 生 生 物 细 胞 线粒体和叶绿体 膜 染色体、质体含核酸 病 毒 综上所述，认为病毒是有机物，而不是生物。 * *7 1.植物病毒的概述 植物病毒的命名 植物病毒的名称目前不采用拉丁文双名法，仍以寄主英文俗 名加上症状来命名，如烟

5、草花叶病毒为Tobacco mosaic virus， 缩写为TMV；黄瓜花叶病毒为Cucumber mosaic virus，缩写为 CMV。 属名为专用国际名称，常由典型成员寄主名称(英文或拉丁文) 缩写十主要特点描述(英文或拉丁文)缩写十virus拼组而成。如 ：黄瓜花叶病毒属的学名为Cucumovirus；烟草花叶病毒 属为Tobamovirus。即植物病毒属的结尾是一virus，科、 属名书写时应用斜体，而种和株系的书写不采用斜体。 类病毒(viroid)在命名时遵循相似于病毒的规则，因缩写名易 与病毒混淆，新命名规则规定类病毒的缩写为Vd，如马铃薯 纺锤块茎类病毒(Potato s

6、pindle tuber viroid)缩写为PSTVd。 * *8 2.植物病毒的形态、结构与组成 2.1植物病毒的形态 观察需要电子显微镜，度量尺度为纳米(nm)。 植物病毒的基本形态为球状、杆状和线条状。 球状病毒的直径大多在20一35nm，少数可以达 到70-80nm，球状病毒也称为多面体病毒或二 十面体(icosahedral particle)病毒。 杆状病毒多为20-80nm100-250nm，两端平齐 ；少数两端钝圆，线状病毒多为1113nm 750nm，个别可以达到2000nm以上。 还有少数病毒与以上形态不同，它们有的看上 去是两个球状病毒联合在一起，被称为双联病 毒(或双

7、生病毒)；有的像弹头，被称为弹状病毒 ；还有的呈丝线状，柔软不定形。 * *9 2.2植物病毒的结构 中间核酸，外为蛋白质衣壳，由许多 蛋白质亚基组成，核酸和蛋白质亚基 均呈螺旋状排列。杆状或条状病毒的 粒体是空心的。 TMV为棒状，CMV球状的。 球状病毒：20面体，蛋白质亚基为60 个或60的倍数，蛋白质亚基在每个面 上不呈螺旋状排列，镶嵌在表面，粒 体中心也是空的。核酸链排列还不清 楚。 * *10 2.3植物病毒的组成 植物病毒主要成分是核酸和蛋白质，核酸在内部，外 部由蛋白质包被，称为外壳，有的病毒粒体中还含有 少量的糖蛋白或脂类。 构成病毒的成分：核酸5-40%，蛋白质60-95%

8、，还有 水分和矿物质等。 类病毒和拟病毒无蛋白衣壳，无专化性血清学反应 ，真病毒有专化性血清反应。 * *11 * 植物病毒主要类型 1.长而弯曲的线状粒体 2.僵直的杆状粒体 3.示杆状或线状病毒核酸与蛋 白亚基的排列 4.杆菌状粒体 5. 杆菌状粒体横切面 6.多角体病毒粒体 7.二十面体的核酸与蛋白亚基的排列 *12 3.植物病毒病的症状特征 一、外部症状(Symptom)： 病毒病害在症状表现上多为系统发病，表现为变色、畸形，少 数引起坏死、腐烂，萎蔫极少发生。 变色：花叶(mosaic)，黄化(yellow)。 坏死(negrosis)：也称作枯斑反应，如TMV侵染心叶烟表现为坏 死

9、枯斑，马铃薯病毒的某些株系侵染烟草可产生脉坏死。 畸形：抑制型：矮化(dwarf)，卷叶(leafroll) ，皱叶(rugose)，蕨 叶 (fernleaf)。 刺激型：丛生(rosette)，肿瘤(tumor)。 * *13 * *14 * 花叶（变色界限明显） *15 * 叶片卷曲 *16 3.植物病毒病的症状特征 二、 病组织的内部和细胞的变化： 1. 组织变化： 组织坏死：如烟草花叶病毒TMV，它侵染心叶烟引起薄 壁组织坏死，有些引起茎部维管束和叶部坏死，烟草花 叶病毒侵染大豆引起顶芽和侧枝坏死。一般引起黄化类 型的病毒病多是因输导组织、韧皮部坏死引起。 组织增生：病毒侵染后，寄主

10、植物体内代谢失调，产生 激素，引起增生。 * *17 * *18 3.植物病毒病的症状特征 2. 细胞的变化： 花叶和斑驳是由于细胞内叶绿素遭到破坏所致。 内含体(inclussion)：某些植物被病毒侵染后，在病组织中产生的 一种特殊结构，存在于细胞质或细胞核中，在显微镜下可以观察 到。分为不定型内含体体和结晶体。 结晶体：有六角型、长条型、正四面体型等，个别的还有皿状， 无色透明，主要是由病毒粒体和寄主的蛋白质有规则地排列形成 。体：无一定形状，半透明，通常外有一层膜，也是由病毒 粒体和寄主物质构成 内含体的作用：植物患病毒病后才有，因此，可作为一种诊 断的指标。 但并不是所有的病毒病都有

11、内含体，有些必须发 育到一定阶段才形成，同时一种病毒还可有多种形态的内含体， 因此，单靠内含体诊断还有一定的局限性。 * *19 * *20 3.植物病毒病的症状特征 三、患病植物的生理变化： 表现为： 病毒侵染后呼吸强度先上升，后下降。 碳水化合物含量下降。 淀粉在叶部积累引起黄化。 多酚氧化酶和细胞色素氧化酶的活性增强，使细胞中毒坏死。 光合作用下降，破坏了寄主的叶绿素。 植物内源激素水平失去平衡，造成畸形。 * *21 3.植物病毒病的症状特征 四、症状变化： 一种病毒引起的症状可因病毒、寄主和环境三方面的因素而改变。 1.病毒本身： 病毒的株系(Strain)：同一种病毒在致病性上也有

12、差异，也称为病毒的 生理小种，为了便于与真菌生理小种的区别，称为株系。有强株系(症 状表现明显，危害较大)和弱株系(症状不太明显)。 如：TMV(弱株系) 番茄 花叶或斑驳 TMV番茄条斑株系(强株系) 坏死，条斑 TMV弱株系侵染烟草引起轻微斑驳，强株系则引起严重花叶。 * TMV（烟草花叶病毒） *22 3.植物病毒病的症状特征 交互保护作用(cross protection)：同一种病毒的弱株系先接 种植物后，就可以保护寄主免受病毒强株系的严重伤害，即先 侵染的病毒可以保护植物不再受亲缘关系较近的另一种病毒的 侵染。 如果两种病毒无亲缘关系则没有这种保护作用。 拮抗作用和协生作用： 拮抗

13、作用：一种病毒侵染寄主植物后，可抑制另一种病毒再 对植物的侵染。如烟草蚀纹病毒可抑制天仙子花叶病毒和马铃 薯病毒对烟草的侵染。 协生作用：两种病毒侵染一种寄主植物后，可使症状比单独 侵染时更为严重，加剧为害。 如：番茄花叶病毒 轻微斑驳 番茄 坏死 马铃薯病毒 轻微斑驳 * *23 3.植物病毒病的症状特征 2. 寄主因素： 一种病毒在不同寄主上可表现不同症状。 如： TMV 普通烟全株型花叶症状 心叶烟局部性坏死枯斑 潜伏侵染：一种病毒感染某些植物后，可以侵染但不表现症 状的现象。 如：小麦黄矮病毒在除小麦之外的禾本科作物上 不表现症状。 同一种病毒侵染同种寄主的不同品种上表现 不同： a.

14、抗病品种：产生局部枯斑反应。TMV心叶烟。 b.高抗或免疫品种品种：病毒侵入后增殖量很少或不能增殖 。 c.耐病品种：侵染寄主后可大量繁殖，但表现症状很轻微， 这与真菌耐病性不同。 * *24 3.植物病毒病的症状特征 3. 环境因素：环境因素可抑制或改变症状的表现。 （1）温度：35或10病害症状轻微，特别是对于花 叶病，如油菜花叶病和TMV。 隐症：已经表现病毒病症状的植株，由于环境条件改 变，症状消失的现象。这种隐症在条件合适时又可重新 表现症状。 隐症：条件不同。 潜伏侵染：寄主不同。 （2）光照：过强、过弱都会影响症状的表现。多数在光弱 时花叶病症状容易表现，接种易成功 * *25

15、植物病毒的分类是将已知病毒按一定标 准、相似程度或相关性的顺序排列，拼 成一个系统，即分类系统。 植物病毒鉴定的主要目的是确定一种病 毒在分类系统中的地位，由于植物病毒 个体微小，结构简单，对寄主的依赖性 强，鉴定工作难度大，技术性强，对工 作条件的要求高。 鉴定植物病毒过去大多采用病毒间生物 学特性的差异，如所致症状类型、传播 方式、寄主范围等；现在则增加了病毒 核酸、蛋白分子生物学、生物化学等方 面的方法。 常用的方法有生物学实验、血清学检测 和电子显微镜观察等。 * 4.植物病毒的鉴定 *26 一、生物学实验 生物学实验的目的是确定病原的侵染性，用实验方法证明病毒与 病害的直接相关性。

16、生物学实验还可以确定病毒的传播方式，明确病毒所致病害的症 状类型和寄主范围。在分子生物学技术尚欠发展的过去，只有生 物学方法可以区分在遗传信息上一个核苷酸或者蛋白质中一个氨 基酸的变异，因此生物学实验是其它实验方法所不可取代的。 生物学实验中应用最多的是鉴别寄主，即用来鉴别病毒或其株系 的具有待定反应的植物。 凡是病毒侵染后能产生快而稳定、并具有特征性症状的植物都可 作为鉴别寄主。 组合使用的几种或一套鉴别寄主称为鉴别寄主谱。鉴别寄主谱中 一般包括可系统侵柒的寄主、局部侵染的寄主和不受侵染的寄主 。如若区分经常出现的黄瓜花叶病毒属的三个成员，采用表41 的鉴别寄主。 。 * *27 表4-1

17、黄瓜花叶病毒属三种病毒 在鉴别寄主植物上的症状反应 鉴别寄主 黄瓜花叶病毒 花生矮化病毒 番茄不孕病毒 花生 无病症 褪绿，矮花叶 无症状 菊花 不侵染 ？ 侵染 黄瓜 花叶 花叶 无花叶 * *28 二、电子显微镜技术 与光学显微镜相比，电子显微镜使用光源的波长更短(属于短波电子流 )，因此分辨率也大大提高(9.9l 0-11m，比光学显微镜高千倍以上)。 但是电子束的穿透力低，样品厚度必须在10100nm之间。所以电镜 观察需要特殊的载网和支持膜，需要复杂的制样和切片过程。 病毒观察最常用的是负染技术和免疫电镜技术。所谓负染，是指通 过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外围的电子密度，使样

18、品显 示负的反差，衬托出样品的形态和大小。与超薄切片(正染色)技术相 比，负染不仅快速简易，而且分辨率高，目前广泛用于生物大分子、 细菌、原生动物、亚细胞碎片、分离的细胞器、蛋白晶体的观察及免 疫学和细胞化学的研究工作中，尤其是病毒的快速鉴定及其结构研究 所必不可少的一 项技术。 * *29 三、血清学技术 抗血清制备：利用植物病毒衣壳蛋白的抗原(antigen)特 性，可以制备病毒特异性的抗血清(antiserum)。先将纯 化的植物病毒注射小动物(兔子、小白鼠、鸡等)，一定 时间后取血，获得抗血清。血清制备的关键是病毒的纯 化，纯度高的病毒才能获得特异性强的抗血清。血清反 应植物病毒与其血

19、清的反应有好多种，但依据的原理都 是抗原与抗体的特异性结合。最常用的两种方法是琼脂 双扩散和酶联免疫吸附测定法。 * *30 琼脂双扩散法：在一定浓度的琼脂凝胶中，抗体和抗原 互相扩散，在适当的位置形成沉淀；沉淀线的形状说明 抗原和抗体的相互关系。 酶联免疫吸附(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay， ELISA)法：该方法利用了酶的放大作用，使免疫检测的 灵敏度大大提高。与其它检测方法相比较，ELISA有突出 的优点：一是灵敏度高，检测浓度可达1-10ngm1;二 是快速，结果可在几个小时内得到；三专化性强，重复 性好；四是检测对象广，可用于粗汁液或提纯液，对

20、完 整的和降解的病毒粒体都可检测，一般不受抗原形态的 影响；五是适用于处理大批样品，所用基本仪器简单， 试剂价格较低,且可较长期保存。具有自动化及试剂盒的 发展潜力。ELISA是实现“快速、准确、经济”检测的最好 手段之一 * *31 四、核酸杂交及PCR技术 血清学技术利用的是病毒衣壳蛋白的抗原性，检测的目标是蛋白 。由于核酸才是有侵染性的，仅仅检测到蛋白并不能肯定病毒有 无生物活性。因此，核酸检测技术也是鉴定植物病毒的更可靠方 法，主要有核酸杂交和聚合酶链式反应(PCR)方法比较常用。 核酸杂交主要在DNA和RNA之间进行，依据是RNA与互补的DNA之 间存在着碱基的互补关系。在一定的条件

21、下，RNA-DNA形成异质 双链的过程称为杂交。其中预先分离纯化或合成的已知核酸序列 片段叫做杂交探针(Probe)，由于大多数植物病毒的核酸是RNA， 其探针为互补DNA(complementary DNA，cDNA)，也称为cDNA探针 。 核酸检测不仅可以检测到目标病毒的核酸，而且还可以检测出相 近病毒(或核酸)间的同源程度。 * *32 聚合酶链式反应(PCR)是在短时间内大量扩增核酸的有效方 法，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA 区段。从已知 序列合成两段寡聚核苷酸作为反应的引物，它们分别与模 板DNA两条链上的各一段序列互补且位于待扩增DNA区段 的两侧。反应时，首先在过量的两

22、种引物及4种dNTP参与 下对模板DNA进行加热变性。随之将反应混合液冷却至某 一温度使引物与其靶序列发生退火。此后退火引物在耐热 的洲A聚合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火 和DNA合成这一循环。每完成一个循环，理论上就使目的 DNA产物增加1倍，在正常反应条件下，经2530个循环扩 增倍数可达百万。 PCR扩增在检测标本中病原的核酸序列、由少量RNA生成 cDNA文库、生成大量DNA以进行序列测定、突变的分析等 方向已经得到广泛的应用。 * *33 五、物理化学等特征 在植物病毒研究的过程中，人们发现不同的病毒对外界条件的稳定性 不同，这便成为区别不同病毒的依据之一。随着新病毒种类

23、的发现和 分子生物学研究的深入，人们也逐渐认识到这些物理特性在区分不同 病毒中的局限性。 1.稀释限点(Dilution End Point，DEP) 保持病毒侵染力的最高稀释度， 用10-1，10-2，10-3表示，它反映了病毒的体外稳定性和侵染能力 ，也象征着病毒浓度的高低。 2.钝化温度(Thermal Inactivation Point,TIP) 处理十分钟使病毒丧失活 性的最低温用摄氏温度表示。TIP最低的病毒是番茄斑萎病毒，只有有 45；最高的是烟草花叶病毒，为97；而大多数植物病毒在55 70之间； 3.体外存活期(Longevity in vitro，LIV) 在室温(202

24、2)下，病毒抽提 液保持浸染力的最长时间。大多数病毒的存活期在数天到数月。 * *34 4 沉降系数及分子量 沉降系数S是指一种物质在20水中 在1达因(1981g)的引力场中沉降的速度，单位是每秒若干 厘米，因这一单位太大，多采用其千分之一，即Svedberg单 位。植物病毒的S20常在50S到数千S之间。沉降系数的测 定要用超速分析离心机，根据该病毒在一定离心力下沉降 的速度来计算。有了沉降系数还可以来计算分子量。 5光谱吸收特性 由于蛋白质和核酸都能吸收紫外线， 蛋白质的吸收高峰在280nm左右，核酸在260nm左右。因此 260280的比值可以表示病毒核酸含量的多少，用于区分 不同的病

25、毒，比值小的多是线条病毒，比值高可能是球状 病毒；对同一种纯化的病毒，紫外吸收值可以表示病毒的 浓度，对未纯化的病毒其260280比值偏离标准值的情况 ，说明病毒的纯度.文献中常有E0.1%1cm260nm值,表示该病 毒在01浓度，光径为1cm比色杯中在260nm处的吸收值 。 6植物病毒的化学特性 主要是指核酸的类型、核酸的 链数以及核酸的分子量、核酸在病毒粒体中的百分含量等 。病毒核酸的这些特性用在病毒的分科、分属之中。 * *35 * 园林植物保护精品课程建设 选用无毒材料 采用茎尖脱毒组织培养法繁殖的无毒 苗，但栽植后必须及时防除传毒昆虫 。 选用抗病品种 选用耐病和抗病优良品种是防治病毒 病的根本途径。 严格挑选无毒繁殖材料，如块根、块 茎、种子、幼苗、插条、接穗、砧木 等，以减少传染来源。 茎尖脱毒 5、病毒病的综合防治 *36 * 园林植物保护精品课程建设 组脱毒育苗 *37 * *38 * *39 *