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1、牙周病分子生物学 Molecular Biology of Periodontal Diseases,李 德 懿 上海第二医科大学附属第九人民医院,一、概述 二、牙周病的分子致病 1.微生物的毒力因子 2.宿主因子 三、核酸杂交法检测牙周病有关细菌,定义（Definition） 分子生物学技术研究与牙周病密切相关生物大分子（蛋白、核酸）的一门新兴学科前瞻性、交叉性。,研究内容 宿主基因水平或分子水平阐明牙周病发病机制和流行规律 牙周病原菌的蛋白和核酸(DNA、RNA)分子结构追踪病原菌传播途径、发现病原体变异。 牙周病的发生发展规律与微观的病原菌或宿主基因特征联系起来牙周病临床的分子诊断、分子
2、指征、分子预后乃至基因治疗,牙周病的分子致病 Molecular Pathogenesis of Periodontal Disease,微生物的毒力因子 研究牙周病原菌的蛋白和核酸分子结构，评价毒力因子的作用。 宿主因子 研究细胞因子和遗传因子的作用。,微生物的毒力因子 Microbial Viralence Factors,内毒素(lipopolysaccharide, LPS) G-菌胞壁外膜的脂多糖成分（磷脂多糖蛋白质）。,十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳 PAGE-SDS gel 银染色 Silver stain 内毒素免疫印迹 LPS-immuno-blotting,牙龈素(gingi
3、pains) 最初称为胰酶样蛋白酶(trypsin-like protease, TLP),又称卟啉素(porphypains) 存在于Pg的外膜、膜泡或胞外的一组蛋白酶 超速离心(10000g20min,4)提取胞外膜泡高凝胶液相色谱法(GF-HPLC)分离纯化。,精氨酸牙龈素(Arginine-gingipains, Rgps): 特异性切断蛋白质与精氨酸残基结合的肽段，由rgpA(前肽区、蛋白酶区、粘附区)和rgpB(无粘附区)二个基因编码 赖氨酸牙龈素(Lysine-gingipain, Kgp): 特异性切断蛋白质与赖氨酸残基结合的肽段，由kgp(前肽区、蛋白酶区、粘附区)单个基因编
4、码,Pg同源突变株的性状改变 突变株 性状改变 rgpA 粘附能力部分丧失 降解I型胶原能力丧失 rgpA、rgpB 抑制中性粒细胞功能丧失 菌毛缺失 kgp 菌落无法变黑(影响利用血红蛋白) rgpA、rgpB、kgp 胞外蛋白水解活性丧失,牙龈素功能 有助于粘附定植：对纤维蛋白的亲和力。 毒性作用：破坏宿主组织细胞的活性成分(蛋白、多肽)、降解胶原；促进缓激肽释放，提高血管通渗性，增加龈沟液量，组织水肿。 帮助细胞生长：将组织蛋白质降解为短肽链，扩大细菌营养摄取范围，为细菌生长和毒力发挥提供养分。 干扰宿主免疫反应：影响中性白细胞功能，降解宿主细胞的LPS受体CD14，降解细胞因子IL-1
5、、IL-6、IL-8及TNF等。,菌毛亚单位蛋白结构基因(fim A) 粘附有关的毒力因子 纤毛素(fimbrilin) 粘附素(adhesin) 血细胞凝集素(hemagglutinin),1988年Dickinson等首先获得含编码Pg纤毛素基因的克隆质粒PUC 13Bg12.1，该基因为染色体上的单拷贝基因，它的氨基酸序列与其他菌毛无同源性，可利用该特异基因作探针鉴定Pg，可进一步研究Pg菌毛的致病作用。,胶原酶基因(prtc) Pg的胶原酶能降解I型胶原，破坏牙周组织附着。 已测知表达胶原酶活性的prtc基因序列，它存在于Pg的三种主要血清型中，编码1个37501.38蛋白质。,白细胞
6、毒素基因(lkt A、B、C、D) Aa是口腔中唯一能产生白细胞毒素(leukotoxin,LKT)的细菌，白细胞毒素仅能杀死人或灵长类的多形核白细胞、单核细胞和巨噬细胞，抑制破坏宿主的免疫防御机制。 现已克隆和测知lkt A的序列，且在受体菌中得到表达。编码毒素结构，激活白细胞毒素。,宿主因子 Host Factors,细胞因子(cytokines) 细胞生物学 细胞因子 cytokine(CK) 免疫学 淋巴因子 lymphokine interleukincytikine(LI) 血液学 集落刺激因子 colony stimulation factor(CSF) 分子生物学 生长因子 g
7、rowth factors(GFS),活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的微量生物活性物质。 本质是蛋白质或多肽。 在体内发挥广泛的生物学作用，与生长、分化、免疫、肿瘤、造血和创伤愈合等多种生理、病理状态有关。 正常情况下发挥广泛生理功能，一旦失调异常分泌，又与疾病相关。,目前发现的细胞因子有10余族，每族又有若干亚族，共100多种，功能大多已阐明，部分已克隆成功，其基因定位、结构与受体结合机制等均有大量研究。,白介素(1-18型糖蛋白)(interleukin, IL) 肿瘤坏死因子(tumor nocrosis factor, TNF) 粘附分子(adhesion molecule, AM)
8、 干扰素(interferan, IFN) 转化生长因子-(transforming growth factor- , TGF- ) 成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs),细胞因子作用特点 特异性(自分泌、旁分泌作用) 对靶细胞存在不同程度特异性。 多样性、多功能性 对不同靶细胞、不同浓度或不同生理状态靶细胞可有不同作用。 整体性 对细胞、组织的调控不是仅靠1种，而是多因子参与及多步骤反应，由几种因子协同或拮抗配合形成网络(network)发挥作用。,遗传因子(genetic factors) 基因水平阐明牙周病发生、发展和流行规律。,细菌是引发
9、牙周炎必不可少的因素，但不是唯一因素，宿主也起重要作用。 单纯遗传能为患严重牙周炎提供50%以上危险性，如： 白细胞减少症 白细胞粘附缺陷病 Down综合征 掌跖角化牙周破坏综合征,牙周病的基因研究 6号染色体组织相容性位点变异 产生IgG2能力降低， IgG2是保护性的，能调理识别细菌，以利吞噬杀死。 染色体1q H131残基多态性 组氨酸纯合子 吞噬细胞识别IgG2的hFcrRa 受体亲和力高(IgG包裹的致病 菌易被吞噬清除) 精氨酸纯合子 受体亲和力低 组/精氨酸杂合子 亲和力居中,染色体2q 13的IL-1基因多态性 产生的IL-1约为该基因阴性的4倍，40岁后患重度牙周炎的可能性是
10、阴性个体的20倍 6号染色体TNF-基因多态性 产生大量TNF-，增强对感染的反应性,核酸杂交法 (molecular hybridization) 检测牙周病相关细菌,概 述,细菌分类学四个水平 细菌形态和行为水平：显微结构、运动性、酶、生化及营养需要等 细菌组分水平：胞壁组分、脂类、细胞色素及噬菌体系分析 蛋白质水平：氨基酸系列、可溶性蛋白凝胶电泳及血清学 基因水平：GC mol%，DNA-DNA杂交，质粒及遗传物质的转导,牙周病有关的特殊细菌 证据充分的致病菌 中等证据的致病菌 伴放线放线杆菌Aa 直肠弯曲菌 (Actinobacillus actinomycetemcomitans)
11、(campylobacter rectus) 牙龈卟啉单胞菌Pg 缠结优杆菌 (Porphyromonas gingivalis) (Eubacterium nodatum) 福塞似杆菌Bf 具核梭杆菌Fn (Bacteroides forsythus) (Fusobacteruim nucleatum) 中间普氏菌Pi (prevotella intermedia) 微小消化链球菌Pm (Peptostreptocoscus micros) 中间链球菌群 (Intermedius streptococci) 牙密螺旋体Td (Treponema denticola),常规方法不能鉴定牙周大量
12、标本细菌的原因： 大多为厌氧菌 培养条件要求高 鉴定繁杂 每牙周袋至少取2个区样本 每样本至少分离10株以上可疑菌,原理 所有生物体都以DNA形式通过4种碱基顺序来贮存遗传信息，同种生物含相同的DNA序列，生物种差别越大，DNA碱基顺序差别越大。 鸟嘌呤 腺嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶 G A C T C T 示踪剂标记的特定碱基序列的核酸片段，能和互补碱基配对、特异地结合。,4种核苷酸组成DNA 2条互补链绕成双螺旋结构(氢键)严格配对规律牢固结合，使DNA具遗传信息贮存库功能（恒定性、专一性） DNA上相邻3个核苷酸编排1个密码子，决定1个特定氨基酸 DNA核苷酸顺序决定蛋白质的氨基酸顺序决定细
13、胞结构和功能,核酸探针(probe) 定义 能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段，用于检测待测样品中是否存在与探针相同或相近的DNA序列。,牙周病相关菌的核酸探针是牙周病相关菌染色体DNA上的有种属特异性的一小段DNA（或RNA）分子的碱基序列，为带标记的单股核苷酸，能以互补方式与相应DNA键结合。用已知细菌的DNA探针去探测未知细菌的DNA，若能杂交形成DNA双链则认为该菌为与探针相同的菌。,放射性同位素标记：如 32P、35S、3H 灵敏度高 理化影响小 污染环境 使用某些半抗原：如 生物素、地高辛、荧光素 特异性较低 敏感性较低,合成小段单链DNA方法日臻完善 寡核苷酸的化学合成
14、可由高度自动化的仪器完成 核酸杂交技术得到发展,探针类型 全基因探针：属内代表菌株分离出DNA并进行标记，制备简便，特异性较差，有时可与相近属菌种发生杂交 克隆DNA片段探针 随意探针：代表菌DNA用限制性内切酶酶切，随意克隆一些片段，找到仅能与本属内菌株杂交的DNA片段 特异性高，但需大量试验方能验证其特异性 特定探针：克隆属内代表菌特异性蛋白或毒力因子的基因，从该基因中取一段作为探针，检验致病菌具独特作用，但需对其特异性、敏感性验证,探针的验证 特异性验证： 必须与50种菌属的80300株菌株进行杂交 必须与相近细菌属中的大量菌间排除“交叉杂交” 如伴放线放线杆菌嗜血杆菌属菌株 敏感性验证
15、： 必须与同属各地区分离的100株以上菌种进行杂交 如核酸杂交结果与生化反应鉴定结果有出入，应进一步验证生化结果。,寡核苷酸(oligonucleotide)探针序列 细菌 探针名称 序列 Aa Aa-2 CTTCGGGCACYAGGGCTAAACCCC Pg Pg-1 CAATACTCGTATCGCCCGTTATTC Pg-3 CTGTGGAATCTTGACGGTATATCG Pg-4 GTATAAAAGAAGTTTAAAYCCTT Pg-5 CCGATGCTTATTCTTACGGTACAT Pg-6 CCTTAGGACAGTCTTCCTTCACGC Bf Bf-2 CGTATCTCATTT
16、TATTCCCCTGTA Bf-4 CTGTAGAGCTTACACTATATCGCA Pi Pi-1 GGTCCTTATTCGAAGGGTAAATGC Pi-2 CCCTAGGYGCGCTCCTCGCGGTTA,特定DNA片段探针序列（基因探针） 细菌 靶基因 序列 长度 Aa Lkta 5-CAGCAAGCTGCACAGTTTGCAAA-3 238bp 5-CATTAGTTAATGCCGGGCCGTCT-3 16Sr DNA 5-GCTAATACCGCGTAGAGTCGG-3 443bp 5-ATTTCACCCTCACTTAAAGGT-3 16Sr DNA 5-CTCAGAGATGGTTTG
17、TGCC-3 273bp 5-AGATTCACTCCCCATCGCTG-3 Pg Fim A 5-ATAATGGAGAACAGCAGGAA-3 131bp 5-TCTTGCCAACCAGTTCCATTGC-3 Prt C 5-ACAATCCACGAGACCATC-3 584bp 5-TTCAGCCACACCGAGACG-3 16Sr DNA 5-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3 404bp 5-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3,续表 细菌 靶基因 序列 长度 Pg 16Sr RNA 5-GCGTATGCAACTTGCCTTAC-3 518bp 5-GTTTCAACGG
18、CAGGCTGAAC-3 Fn 5047 5-CAAATGCTTGTGTCAATAATACT-3 0.5Kb 5-TTTAGAAGAAATGGTAGAATAAT-3 50590 5-ATTGTGGCTAAAATTASTAGTT-3 1Kb 5-ACCCTCACTTTGAGGATTATAG-3 Pi 18Sr RNA 5-CCTAATACCCGATGTCCACA-3 855bp 5-AAGGAGTCAACATCTCTGTATCC-3 Td TdpA 5-AAGGCGGTAGAGCCGCTCA-3 311bp 5-AGCCGCTGTCGAAAAGCCA-3,PCR扩增16SrRNA 基因病原菌检测
19、遗传学分类 rRNA是细胞中最多的一种RHA，很多分子组成核蛋白体(核糖体)，rRNA分子大小一般用超速离心的沉降系数S表示，S越大，分子也越大。,16SrRNA基因：细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列 保守区稳定性（细菌共有，称“分子化石”） 可变区特异性（保守区间有V1V10可变区，含种属差异信息，如出现3个碱基以上差异，便可判定不同属） 多拷贝敏感性（约1500个核苷酸，每细菌含510个拷贝）,16SrRNA编码基因 保守区的引物：对所有细菌均适宜的引物 可变区的引物：PCR扩增，凝胶电泳可鉴别细菌种属 间隔区的引物：16SrRNA和23SrRNA编码基因间存在0.5Kb间隔区，
20、不同种属间隔区长度的序列有特异性，可鉴别细菌种属,优点 灵敏度高、特异性强、提高检测质量 不依赖培养，可直接从标本检测 可鉴别营养要求复杂，生长缓慢微生物，特别目前不能体外培养繁殖的细菌 能克服表型变异影响：形态变化、死菌、混杂菌 能鉴定菌种、毒种及亚种（提供不同病原体DNA分子“指纹”图，未解释病因学、流行病学 可检测细菌对抗生素的耐药现象,缺点 技术过于苛求，需一定条件和设备 大部分探针需进口，化费较大,应用 牙周细菌分类、分型、快速检测 评估细菌毒力因子作用 检测细菌基因异常及异常表达 临床检测、流行规律,小 结 牙周病分子生物学是研究牙周病原体的蛋白和核酸(DNA, RNA)分子结构，用分子生物学方法追踪病原体传播途径，发现病原体变异；从宿主基因水平或分子水平阐明牙周病的发病机制和流行规律，将宏观的牙周病发生发展规律与微观的宿主或病原体基因特征联系起来，逐步建立牙周病临床的分子诊断、分子指征、分子预后乃至基因治疗。,细菌分类已从表型特性鉴定深化为基因特征分类，从形态、生化提高到基因、分子水平。快速、经济、简便的核酸杂交法给牙周病的病因研究和临床检测带来很大便利。,