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1、电压门控钠通道亚单位在大鼠肠易激综合征模型中变化的研究胃肠病学2006年第11卷第3期电压门控钠通道亚单位在大鼠肠易激综合征模型中变化的研究王亚雷姚玮艳章永平乔敏敏袁耀宗上海交通大学医学院附属瑞金医院消化内科(200025)?143?背景:电压门控钠通道(VGSC)在神经元动作电位的产生和传递中起着极为重要的作用.近年来它与内脏高敏感性的关系越来越受到重视.目的:探讨VGSC亚单位的变化与大鼠肠易激综合征(IBS)内脏高敏感性之间的关系.方法:以新生大鼠直肠内气囊扩张制作IBS的动物模型,在其成年后取L6一S2脊髓背根神经节,采用逆转录聚合酶链反应(RT.PeR)半定量法对背根神经节细胞表面V
2、GSCNav1.1,Nav1.6,Nav1.7,Nav1.8和Nav1.9五种仅亚单位mRNA的含量进行检测.并以原位杂交的方法对Nav1.8的表达进一步加以确认;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法对大鼠肠道组织神经生长因子(NGF)的含量进行检测.结果:背根神经节细胞表面仅亚单位Nav1.8mRNA的表达增加,而Nav1.1,Nav1.6,Nav1.7和Nav1.9的表达没有改变,原位杂交定性分析也证实造模组Nav1.8含量增加;造模组肠道组织NGF的含量显着高于对照组.结论:新生大鼠直肠内气囊扩张使其脊髓背根神经节细胞Nav1.8mRNA的表达增加,而其他几种常见亚单位的含量均未发生改变
3、.这种变化可能与肠道组织NGF表达的增加有关.关键词大鼠;肠易激综合征;内脏高敏感性;电压门控钠通道;神经生长因子Alterationofd-SubunitofVoltage-gatedSodiumChannelsinaRatModelofIrritableBowelSyndromeWANGYalei,YA0Weiyan,ZHANGYongping,QatOMinmin,YUANYaozong.DepartmentofGastroenterology,RuiinHospital,snngJiaotongUnwenitySchoolofMedine,sg(200025)gaci,round:Vo
4、ltagegatedsodiumchannels(VGSC)arecrucialforthegenerationandpropagationofactionpotentials.Someresearcherssuggestedthatvoltagegatedsodiumchannelswerealteredinmanygastrointestinaldiseases.Aims:Todeterminewhichvoltage-gatedsodiumchannelisinvolvedinvisceralhypersensitivityofirritablebowelsyndrome(IBS).Me
5、thods:AnanimalmodelofIBSwasestablishedbygivingrectalballoondistensionintheneonatalSpragueDawleyratsonpostnataldays8.10and12.TheL6一S2dorsalrootgangliawereremovedafterenteringadulthood.Theexpressionsoffive仅一subunitsofVGSC:Nav1.1,Nav1.6,Nav1.7,Nav1.8andNav1.9mRNAsinthedorsalrootganglionneuronsweredetec
6、tedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PeR),andtheincreasedexpressionofNav1.8wasconfirmedbyinsituhybridization(ISH).Nervegrowthfactor(NGF)expressionincolontissuewasmeasuredbyenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA).Results:Amongthefive仅一subunitsofVGSCexamined,onlyexpressionofNav1.8mRNAwash
7、igherinneonatalrectaldistensiongroupthanthatinthecontrolgroup.ThemodelratshadmoreNGFincolontissuethaninthecontrols.Conclusions:Neonatalrectalballoondistensiontreatmentinmicemayaltertheexpressionof?subunitNav1.8,whichmaybeassociatedwithincreaseofNGFinthecolontissue.KeywordsRats;IrritableBowelSyndrome
8、;VisceralHypersensitivity;VoltageGatedSodiumChannel;NerveGrowthFactor电压门控钠通道(vohage.gatedsodiumchannels,VGSC)在神经元动作电位的产生和传递以及细胞膜兴奋性的维持中起着极为重要的作用.它在内脏疼痛发生,发展中的作用越来越受到重视.在胃溃疡【lJ,胃炎【2J和回肠炎【3J等疾病的动物模型中均有报道.我们前期的研究141也发现.在新生大鼠本课题由国家自然科学基金项目(No.30570830)资助本文通讯作者,Email:yyz28medmail.corn.an肠道刺激造成的肠易激综合征(IBS
9、)内脏高敏感模型中,VGSC发生改变.主要表现为河豚毒不敏感(1r)(.R)与河豚毒敏感(1_I)(.S)钠通道峰电流比值增大,而通道本身的激活和失活等特性没有发生改变.但对这种电流改变是哪些亚单位的表达发生改变所致,目前尚无报道.本研究采用逆转录聚合酶链反应(RTPeR)法对背根神经节(dorsalrootganglion,DRG)中常见的几种亚单位mRNA进144行检测.并通过原位杂交法对Nav1.8的表达作进一步确认.同时,由于神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)在疼痛的发生,发展中起着重要作用,且NGF又与VGSC的表达关系密切,本研究还初步探讨了在IBS内脏高敏
10、模型中是否有NGF的参与.材料与方法一,材料聚合酶链反应(PCR)扩增仪为Gene公司产品:凝胶摄像系统为BioRad公司产品:紫外分光光度仪为Beckman公司产品:Trizol试剂购自Invitrogen公司:逆转录和PCR扩增所用试剂以及NGFEmax免疫测试系统均购自Promega公司.RTPCR所用引物由上海生工生物工程有限公司合成(见表1).针对Nav1.8mRNA特异性的寡核苷酸探针用地高辛标记.由武汉博士德生物工程有限公司合成.其序列为:5一TACAGCACACACCGGACATrCATGGTG一3:5一AATCAACCAGTTCTTTGTGGCCGTCTTCAC一3:5一TA
11、TGGAAGAGAAGTTTATGGCGACCAATCT一3.表1FIT.PCR所用引物序列和片段大小组别引物序列片段Cop大)小.上游5一CCAACCGTGAAAAGATGACC一3acn下游5,一CAGGAGGAGCAATGATCTTG一3,660scnla上游5一CATCATCrrCGGCTCGTYCT一3(Nav1.1)下游5一GCTTGTCACATAATCGCTCTGG-3scn8a上游5一G1TICATCGGTGTCATCATCG-3(Nav1.61下游5一CAAGGCAAACATrITTrrGAGCA一3scn9a上游5.1TICGGCTCArrC1TICACG1TI一3(Nav
12、1.7)下游5一CACTCCCCAGTGAACAGGAT一3scn10a上游5一GACCCRTGGAATTGGlTIGGA一3(Nav1.81下游5-GAGGAATGCCCACGCAAAGGAATc3senlla上游5-CCCTGCTGCGCTCGGTGAAGAA.3av1.9)下游5一GACAAAGTAGATCCCAGAGG-3二,方法1.模型制备,分组和饲养:取l6只新生SpragueDawley大鼠(购自中国科学院上海实验动物中心),仿A1一chaer的新生大鼠肠道刺激的方法5制备IBS模型,即在新生大鼠第8,l0,l2天分别予以直肠内气囊扩张,所用气囊为3FFogarty动脉取血栓导管
13、(美国EdwardsLifescience公司),每次扩张注入气体0.2ml,持续1min,然后放气,退出导管.对照组采用同样的方法,肛门内插入气囊导管.但不扩张.1min后拔出导管.每组8只大鼠.新生大鼠与母鼠ChinJGastroenterol,2006,Vo1.11,No.3共同饲养.予母鼠充足的食物和水分.25天后将母鼠与幼鼠分离.分离后的幼鼠每4只一笼,给予充足的食物和水分.大鼠成年后(>2个月)断头处死,在冰上迅速取出L6S2节段脊髓背根神经节和直肠(距肛缘1cm.所取标本长度约为1cm),保存于一70冰箱,以备RTPCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测.2.o【一亚单位
14、RTPCR检测:总RNA以Trizol抽取,测260nm/280nm的吸光度(A)值,计算RNA浓度.按逆转录反应试剂盒步骤操作行逆转录合成cDNA链后,再以逆转录反应液2l作为模板,加入引物,dNTP,Taq酶等,用PCR仪扩增,行PCR反应.反应条件为:Bactin:变性94oC1min,退火601min.延伸72oC1min.共30个循环.72延伸10min终止反应;Nav1.1,Nav1.6和Nav1.7:变性94oC1min.退火59oC1min.延伸68oC1min.共33个循环.68延伸10min终止反应:Nav1.8和Nav1.9:变性94oC1min.退火60oC1min.延
15、伸7290s,共33个循环,延伸10min终止反应.反应结束后扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳.紫外自动凝胶成像系统摄影.以Bactin为内参照标化各亚单位的mRNA含量,计算灰度值.灰度值=目的基因检测值/13一actin检测值x100%.3.原位杂交:用冰冻切片包埋剂OCT包埋的标本按10p,m厚行冰冻切片,4%多聚甲醛室温固定l015min,蒸馏水充分洗涤,60烘干2h后.一20保存备用.切片上滴加3%胃蛋白酶.37消化2min.0.5mol/LTBS洗涤5minx3次.蒸馏水洗1次:2SSC平衡15min;37oC预杂交2h.然后加上Nav1.8杂交探针,37l824h:杂交后分别以
16、2xSSC,1SSC,0.2xSSC37oC振荡洗涤15min:滴加封闭液20l,3730min;滴加生物素化鼠抗地高辛20l,室温放置2h,0.5mol/LTBS洗涤5minx3次;滴加SABC,37oC30min,0.5mol/LTBS洗涤5minx3次;BCIP/NBT显色后,梯度酒精脱水.二甲苯透明,中性树胶封片.杂交前所用试剂/器械均行去RNA酶处理4.肠道组织中NGF含量的检测:采用EHSA法.肠道组织置于裂解液中,行组织匀浆.裂解液组成为:137mmol/LNaC1.20mmol/LTrisHC1(pH8.0),l%NP40,10%甘油,1mmol/LPMSF.10g/ml抑酶肽
17、,1g/ml亮抑酶肽,O.5mmol/L钒酸钠.匀浆后,川与r=.】蓝法愤洲总噩浓l变,fI:j愉删按照LJ制眦II.Fj掸怍压终止.:平舨晌仪450._处l已III?缆fJ:-数VJ,x+s蠢;.什盘P<O,0匈茸蚌f显一RT-ICI,宅俭使J列照凡l议冲雏胞袁V(:Ti(f1l1ltNf1嗣I是!5个毓-I.只有III(),I8)的麦连造模川苦r刈组(P<O.05J+.nIe袅4个的表达舯魁fIL较均尤艟什譬一背魁冲绎胆】8l,A原f宜坫表2模型组与对照组太鼠背根神经节细胞表面VGSC五种a亚单位mRNA含量灰度值的比较c)神经可见I1】OaIIIRNAij的刘胞fI包不l.圳
18、胞桉巷包I弛色探浅不一.圩布不均.以背擞神始节边较多造髓组Ili_阳l?数叫显较多.其厂r深染的胞敬也多丁对肌c同21,1j直HlINGF的EI_I捡制4造惯f1肠道引I织th,Cl:的量为l1_1713.I6pg,fln蛋白.对,Itf,H为2.38pg/mg88lg受Ii.丽纽之间有蔷差砰(P<O.051Il纠3).6lI-479II6rioI1qI-I661hi.1.ilB:&m41!位窜行髓背讯科缔节n1(I_t的丧】【xIO0)3对0lfi毡蛙卅r【-tNG1的晡乳动物的vGST;,似仃l0刊,l司惮赁IlN11N19椰fix.贾是感受恤脱Ha伥窿磬JN_l帕辅E幔收.
19、挂饿胜敞感mIIUtl;敞感他9种不旧组织-+|其种娄垃不同的.fNavI5多于胎J胡目特JJLIH胞失神经疋杵肌细胞世L,肌旭的lnJNavl3脞只H1】_!.胎驯计经川胞E经t6l协后阿:冲经钏胞表【fiiii止常均脊髓l根经节细吣丧.存N.vIIL6NavI7NI8NI9种业型,l工.NLINav16INayI7腾rrIXS型而NayI8棚NI9丁rrxl剐1研兜采川LCRl定避法幢删发舰造棱州眦神绎节圳儿世xH型l雠NI8n1RNA的世高丁_对j啜组【他l1种-Ik值的量没改这与以仆电生=I=研究们发现【j土啊台的I8上m十善性感觉神经元,剐曾触称作感啦神经儿特异性(lIlIl1一nt
20、.IificSNS】伸,Irl比-I】fl伤害托f/逊过i日氪篮地伸托帚研究i证.,十炎痛鲐撕的发f=过-l-avl8逃均1_】f增JJlrN.nI8H庄g哺I的作删也已刊证宴,JH琏敲除技求和臣望缚桂仵喻拙水降低N扑18l表J0iJ脐低限内痛州牵涉墒唧f研究i.支配体感觉的背根冲经雌物艇誊Ill4阳性细胞为主70%I往点肠J慌的背根冲始细胞巾则NGF至f水TrkiiH性细胞8)啦上11:14性细胞仅占I4睨207,.般认为B4与皿甲位Ni9竹敞肠敏感增高构过程巾.NI9参j且-I-的口B赶卞研究世证蛮1这一Nnvl7挂一种下rx.S征世.=F婴竹布r感箍种冗构求圳究iI发珊.角胶所致的炎生期
21、.uv17RA的这增】Nassar普宋川泉行法部分胜鼎nq.发现大鼠机目l热搏捕值啕增加造6_究均表叨NayI7疼蝻艟弧作刚忸我成年的造榛大i,求发州这.越惮的训是r仃往nxS的改尚蒋世一步研究(,硅盟埕嘎的神摊营养隶宗篪的成员萁主能屉促世仲托系统的长发育维持神经JLIrJ荇活.化址种经元的长和分化(与Nayl8佝丧荧泵讲州许多研究发现.舡佛讣分离堵养irj根I节细胞t【_,l,F.1Ui1控钠离子电流埔几【ii,i:I,li过崖表达的转小鼠HNay18呈表达/i:降觚大鼠怍内NG17水平例以使Nay1靶低IflI十成年大鼠背根冲择神绎儿小套台成fJ幔通过外冈束扪M配的绁缈挂取N【F研为丁解遗
22、性州,l8音丛的j加足有(.书究采ISA法御堆竹删了世,.0.一.一.盏.一一胃肠病学2006年第11卷第3期模大鼠结肠组织中的NGF含量.结果发现,造模组大鼠肠道组织中NGF的含量显着高于对照组.对于NGF表达的增加.其可能的原因为:新生期扩张.局部产生炎症,组胺,前列腺素(PG)E和5一羟色胺(5-HT)等炎症介质增加,使NGF表达增加;同时精神应激可以增加下丘脑一垂体一肾上腺轴的活动.而后者又可促进NGF的表达.本研究造模的时间为新生期.而在发育阶段NGF的增多可以导致支配其的感觉神经元上受体表达的增多.故模型组大鼠成年后虽然肠道的炎症并不明显.但NGF的含量较高.这种假设尚需要进一步研
23、究证实.总之.在新生大鼠肠道刺激造成的IBS内脏高敏感模型中.脊髓背根神经节细胞表面Nav1.8mRNA的表达增加.而其他常见的几种亚单位的表达均未发生改变.这种变化可能与肠道组织中NGF表达的增加有关.2345678参考文献BielefeldtK,OzakiN,GebhartGF.Experimentalulcersaltervoltage-sensitivesodiumcurrentsinratgastricsensoryneurons.Gastroenterology,2002,122:394-405.BielefeldtK,OzakiN,GebhartGF.Mildgastritisa
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25、道在大鼠肠易激综合征模型中的变化.诊断学理论与实践2005.4:140144.LinC,A1-ChaerED.Long-termsensitizationofprimaryafferentsinadultratsexposedtoneonatalcolonpain.BrainRes.2003.971:7382.GoldinAL.Resurgenceofsodiumchannelresearch.AnnuRevPhysio1.2001.63:871894.BlackJA,DibaajjS,McNabolaK,JesteS,RizzoMA,KocsisJD,WaxmanSG.Spinalsenso
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