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1、时间分辨荧光技术,广州市源起生物科技有限公司,培 训,主要内容,时间分辨荧光免疫技术（TRF）定义。 TRF的标记物及特点。 为什么叫“时间分辨”? TRF在免疫分析方法学中的地位。 各种免疫方法学的比较。 临床应用,回顾标记免疫学发展,放射免疫 （精度：10-12mol/L ） 酶联免疫 （精度：10-9 mol/L ） 胶体金标记 （金标：10-15mol/L ） 化学发光 （精度：10-15mol/L ） 电化学发光 （精度：10-17mol/L ） 时间分辨荧光（精度：10-18mol/L ） 生物芯片,时间分辨荧光技术 （Time-Resolved Fluorescence）,时间分
2、辨荧光免疫分析 （TRFIA） 时间分辨免疫荧光分析（TRIFMA） 时间分辨荧光核酸探针分析 时间分辨荧光细胞活性分析 时间分辨荧光探针分析,时间分辨荧光技术原理 （TRF）,用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质； 当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点 （特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。,时间分辨荧光免疫原理图,（Time-resolved Fluor
3、escence Immunoassay）,时间分辨荧光免疫试剂 工作原理示意图,微量反应孔,包被好的表面抗体,表面抗原,螯合剂,Eu,重链,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,标记物为具有独特荧光特性的稀土金属-镧系元素,镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种： 铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Te) 镧系元素荧光特点： 荧光寿命极长 镧系元素螯合物（60900 us) 普通荧光免疫中荧光团：1100us 样本中蛋白质荧光：110us，易猝灭。 Stokes位移大（大约290nm） 铕：发射光613nm、激发光340nm， 荧光素的Stokes位
4、移为28nm 荧光特异性强。（发射光谱带很窄：615 5nm） 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍,利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0,时间分辨荧光免疫原理图,利用镧系元素光谱特点，将发射荧光与激发荧光分辨开来，零本底的又一保障,发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离。,DELFIA技术为临床检测带来的先进性,灵敏度更高，检测范围更广,以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书 试剂 DELFIA Immulite ACS-180 AFP 0.1-1000IU/m
5、l 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml HCG 0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L TSH 0.005-100U/ml 0.002-75U/ml 0.03-150U/ml FSH 0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog 0.08-120nmol/L 无 0.1-40ng/ml Prolactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml,时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定
6、， 同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标,0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500 U/L,5,100,2000,Cps.10 3,DELFIA hFSH,N=6,标准曲线稳定，试剂保质期时间长,放射性免疫分析法（RIA）,应用 放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。 夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。,缺点 放射性（125 I），对环境的污染及对身体的危害，该方法已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室） 125 I 的半衰期短而导致其试剂有效期短。 标记物125 I 的稳定性差
7、，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。 操作繁琐，出报告时间长。 无法保存备用。,酶免疫分析法（ELISA ）,应用 酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害。 试剂有效期较长。 衍生技术： 荧光酶免疫分析 增强化学发光酶免疫技术 曾经一度被认为是取代放免的检测手段。,缺点 灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。 因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好。,化学发光免疫分析法（CLIA）,应 用 单个样本检测速度快，适合做急诊。 灵敏度较高。 自动化程度高。 分类： 以丫啶酯直接标记ACS180系统 以HRP标记，鲁米诺为发光底物Ame
8、rlite系统 以AP为标记物，AMPPD为发光底物Immulite系统,缺 点 发光过程短，样品不能重复检测。 本底较高，易受环境物质干扰。 仪器故障率较高。 试剂稳定性较差，需多次定标。 检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足。 非开放性试剂；试剂价格高。,电化学发光免疫分析法（ECL）,应用 80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法。 基本原理：根据三联吡啶钌Ru(bpy)3和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应。 本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽。,缺点 非开放性试剂系统、不能做科研。 试剂价格过高。,时间分辨荧光免疫的试剂种类,内分泌科检查 甲状腺系列： TSH，U
9、ltra TSH，T3，T4，FT3，FT4，TBG，TG 糖尿病系列： Insulin， C-Peptie 生长激素类： hGH 其他： Cortisol 妇产科检查 FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG 肿瘤科检查 AFP，CEA，PSA，hTG，-2 Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSA EQM，CA-50，CA-125，CA-199，CA-153*，CA-724*，CY-211* 遗传科检查 产前筛查： hAFP/ HCG ，PAPPA 新生儿筛查： Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a
10、-OH Prog，PKU 核酸探针及基因杂交检测，多标记定量PCR检测。 肝炎系列 甲肝，乙肝，丙肝 血液科检测 贫血检查： Ferritin，Vit B12，Folic acid 白血病： 免疫细胞分型等 细胞学检查 细胞毒试验等多种检测项目，细胞质及组织化学分析等多种检测项目 酶类检测及细胞受体检测（包括MHC，HLA等多种检测） 科研工具 单标记检测，双标记检测，三标记检测，四标记检测,时间分辨荧光免疫-突出优点,零本底、灵敏度高 线性范围宽 试剂有效期长 标准曲线稳定性好 易于自动化 TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。,时间分辨荧光与化学
11、发光方法学比较,时间分辨荧光 化学发光 发光效率 95% 1% 重复检测 可无数次 不可重复 本底噪声 零本底 干扰大 灵敏级数 10-18 10-15 标记物 原子 大分子化合物 标记位点 可达20个/抗体 1个/抗体 标准曲线 稳定达一年以上 稳定 2 到 4周 多标记 有，最多可达四标记 无 科研开发 有 无,时间分辨荧光和电化学发光的比较,时间分辨荧光 电化学发光 标记物 四种原子: Eu, Sm, Te, Dy 一种原子: 钌 多标记技术 有 无 做科研 能(1000多种科研项目) 无 试剂种类 58种临床,24种科研,共82种 28种临床, 无科研试剂 试剂价格 低 高,泰莱I时间分辨荧光免疫分析系统,泰莱I时间分辨荧光免疫分析系统,高灵敏度 10-17mol/孔(Eu3+) 线形范围宽 10-13mol/孔10-19mol/孔 快速测试 1秒/一个样品 测试灵活 可以测试任意1-96个孔，样品摆放位置不受限制 标本量灵活 随机配置泰莱I全中文测试分析软件 界面简明友好，随意进行项目的选择和参数筛选,谢谢各位光临！ 敬请各位指出不足并多提建议,