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1、 基因工程的基本操作程序 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 1.基因工程的操作步骤正确的操作顺序 是 使目的基因与运载体相结合将目的基因 导入受体细胞检测目的基因的表达是否符 合特定性状要求提取目的基因 A B C D C 步骤一：步骤一：目的基因的获取目的基因的获取 目的基因是人们所目的基因是人们所需要转移需要转移或或改造改造的基因的基因 , , 获取目的基因是实施基因工程的第一步获取目的基因是实施基因工程的第一步 。 如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植 物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮物
2、的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮 藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰 素基因等。素基因等。 目的基因的提取方法目的基因的提取方法 人工合成基因人工合成基因 反转录法反转录法 根据已知的氨基酸序列根据已知的氨基酸序列 合成合成DNADNA ：鸟枪法：鸟枪法 直接分离基因直接分离基因 从基因文库中获取 基因组文库 cDNA文库 1 . 1 . 鸟枪法（散弹射击法）鸟枪法（散弹射击法） 用限制酶将供体细胞中的用限制酶将供体细胞中的 DNADNA切成许多片段，从中找出切成许多片段，从中找出 含有目的基因含有目的基因. . 用限制酶切断成 许多片段 1 1）
3、反转录法反转录法： 以目的基因转录成的信使以目的基因转录成的信使 RNARNA为模板为模板 反转录成互补的单链反转录成互补的单链DNADNA 在酶的作用下合成双链在酶的作用下合成双链 DNADNA，从而获得所需的基，从而获得所需的基 因因 目的基因的目的基因的mRNAmRNA 单链单链DNA(cDNA)DNA(cDNA) 双链双链DNADNA ( (即目的基因即目的基因) ) 反转录反转录 合成合成 2.人工合成基因法 2 2）根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法 法 ： 根据已知蛋白质根据已知蛋白质 的氨基酸序列，推测的氨基酸序列，推测 出相应的信使出相应的信使RN
4、ARNA序序 列，然后按照碱基互列，然后按照碱基互 补配对原则，推测出补配对原则，推测出 它的结构基因的核苷它的结构基因的核苷 酸序列，再通过化学酸序列，再通过化学 方法，以单核苷酸为方法，以单核苷酸为 原料合成目的基因。原料合成目的基因。 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列 mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列 推测推测 推测推测 目的基因目的基因 化学合成化学合成 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 优点缺点 鸟枪法 反转录法 根据已知氨基酸 合成DNA法 操作简便操作简便 广泛使用广泛使用 工作量大
5、，盲目，分工作量大，盲目，分 离出来的有时并非一离出来的有时并非一 个基因个基因 专一性强专一性强 操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA 很不稳定，要求的技很不稳定，要求的技 术条件较高术条件较高 专一性最强专一性最强 仅限于合成核苷酸对仅限于合成核苷酸对 较少的简单基因较少的简单基因 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？ 1 1）DNADNA序列自动测序仪：序列自动测序仪： 2 2）PCRPCR技术：技术： 对提取出来的基因进对提取出来的基因进 行核苷酸序列分析。行核苷酸序列分析。 使目的基因的片段使目的基因的片段 在短时间内成百万倍在短时
6、间内成百万倍 地扩增。地扩增。 3 3）从基因文库中获取目的基因：）从基因文库中获取目的基因： 基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入 受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的 不同的基因,称为基因文库(gene library) 基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基 因文库叫做基因组文库. 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基 因文库叫做部分基因文库. 用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内 切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质 粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细 胞的增
7、殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆 多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称 为该种生物的基因文库。这一定义也适用于线粒体DNA和叶 绿体DNA，分别称为某种生物的线粒体基因文库或叶绿体基 因文库。为了有效地保存基因文库，可通过细菌在固体培养基 上繁殖而使包含各个特定DNA片段的细菌增多。通过分子杂 交的方法，可以筛选出包含有所需基因的DNA片段的细菌（ 或噬菌体）。经过扩增得到大量这样的细菌（或噬菌体），从 中便可分离出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文库是 分离高等真核生物基因的有效手段，对于基因定位和基因工程 的研究都很有用。 步骤二：步骤二：基因表达载体
8、的构建基因表达载体的构建 1 1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一 个切口，露出黏性末端。个切口，露出黏性末端。 2 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产）用同一种限制酶切断目的基因，使其产 生相同的黏性末端。生相同的黏性末端。 3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口）将切下的目的基因片段插入质粒的切口 处，再加入适量处，再加入适量DNADNA连接酶，形成了一个重连接酶，形成了一个重 组组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际 上是不同来源的上是不同来源的基因重组的过程基因重组的
9、过程。 常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌 、酵母菌和动植物细胞等。、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 步骤三：目的基因导入受体细胞步骤三：目的基因导入受体细胞 直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等 方法。 （1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。 （2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注 入宿主细胞。 （3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。 （4）基因枪法：
10、在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主 细胞中。 间接导入法常用的载体是质粒、噬菌体、科斯质粒。 （1）质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分子，它能自 我复制，也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常 还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。 （2）噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNA可以作为目的基 因的载体。 （3）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和噬菌体的部分顺序 ，很适合用作真核生物基因的载体。 1.将目的基因导入植物细胞 2.将目的基因导入动物细胞 3.将目的基因导入微生物细胞 大肠杆菌细胞最常用的转化方法是: 首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的
11、通以增大细菌细胞壁的通 透性透性, ,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子 的生理状态,这种细胞称为感受态细胞. 第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液 中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态 细胞吸收DNA分子,完成转化过程. 第二步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而目的基因在受体细胞内，随其繁殖而 复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时 间内就能获得大量的目的基因。间内就能获得大量的目的基因。 1 1）将细菌用）将细菌用CaClCaCl 2 2 处理，以增大细菌细处理，以增大细菌细 胞壁的通透性。胞壁的通透性。 2 2）使含有目的基
12、因的重组质粒进入受体）使含有目的基因的重组质粒进入受体 细胞。细胞。 3 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而 复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很 短的时间内就能获得大量的目的基因。短的时间内就能获得大量的目的基因。 步骤四：目的基因的检测与鉴定步骤四：目的基因的检测与鉴定 四环素四环素 抗性基因抗性基因 氨苄青霉氨苄青霉 素抗性基因素抗性基因 不能，受体细胞必须表现出特定的性状不能，受体细胞必须表现出特定的性状 ，才能说明目的基因完成了，才能说明目的基因完成了表达表达。 受体细胞摄入受体细胞摄入DNADNA分子后就说明目
13、的基因分子后就说明目的基因 完成了表达吗？完成了表达吗？ 若不能表达，若不能表达， 要对抗虫基因要对抗虫基因 再进行再进行修饰修饰。 前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效 利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。 这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少， 必须将它从中检测出来。 无表达产物无表达产物 有表达产物无表达产物 细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落， 检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产 物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。 多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培 养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄 入目的基因，摄入的基因是否
14、表达（是否表现出 相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应 变化的个体进一步培养、研究。 例：用棉铃饲喂棉 铃虫，如虫吃后不出现 中毒症状，说明未摄入 目的基因或摄入目的基 因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了 抗虫基因并得到表达。 基 因 工 程 的 基 本 操 作 程 序 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 1、从基因文库中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因 3、化学方法人工合成 复制原点 + 目的基因 + 启动子 + 终止子 + 标记基因 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、Ca2+处理法 DNA分子杂交技术、
15、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术 分子检测外的个体水平鉴定 1 1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列酸序列 B B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C C、运载体必须具备的条件之一是：具有多、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来 C C 练习练习 2 2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A A、
16、能复制、能复制 （ ） B B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C C、具有标记基因、具有标记基因 D D、它是环状、它是环状DNADNA D D 练习练习 3 3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶 A A 练习练习 4 4）有关基因工程的叙述正确的是
17、）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供、蛋白质的结构可为合成目的基因提供 资料资料 D D 练习练习 5 5）基因工程是在）基因工程是在DNADNA分子水平上进行设计分子水平上进行设计 施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行 碱基互补配对的步骤是碱基互补配对的步骤是 （ ） A A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B B、目的基因与运载
18、体结合、目的基因与运载体结合 C C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达 C C 练习练习 执业医师考试 执业医师考试 wpe36xrz 是在这里蹲点吧！”“你就不能配合点吗。”“你又没让我配合。”被人遗忘的慕容凌娢终于从地上站了起来，但 感觉自己的脑细胞正急速死亡，智商再次跌入谷底。韩哲轩怎么会知道我的真名？百蝶好像也知道他去找过夏桦。“呃 ”慕容凌娢强壮镇定的笑了笑，“韩哲轩你怎么会在这里？”“百蝶不是说了吗，我就是在这里专门等你们的。” 韩哲轩极其爽快的承认了自己的行为，“我看见你们两个出来，就跟上了。刚想叫住你就看见你往
19、后摔了幸好我闪 的快”这剧情跟我想的怎么不一样？按照言情小说的正常套路，我不是应该被人准确无误的接住吗？然后不就顺理 成章的慕容凌娢居然做起了花痴的白日梦。慕容凌娢把自己的幻想和现实仔细对照了一下，又看了看面前这个笑得 漫不经心的人，悲痛的捂住了脸童话里的故事果真都是骗人的自己怎么能指望这种人呢？“凌娢你怎么了？” 百蝶看着一直发呆的慕容凌娢，稍许有些担忧，“不会真的摔傻了吧！”“没没事。”慕容凌娢紧张的摇了摇头， 生怕百蝶看出什么端倪。“不过韩哲轩，你怎么会知道我的真名？”既然韩哲轩知道了自己的名字，也就是知道了自己 一开始就说了谎，真的好尴尬啊！“像我这种开挂玩家，怎么能连这种东西都不知道
20、呢。”韩哲轩居然没有再提起“白 绫”这个化名，这让慕容凌娢很是欣慰。“是夏先生告诉你的吧！”慕容凌娢绝对不会相信这是可以猜到的东西。“如 果你乐意这样想，我不介意。”(古风一言)那时，谁绣芙蓉鸳鸯戏。而今，谁惹青丝千里外。第016章 原来不是青楼“ 是夏先生告诉你的吧！我的真名。”慕容凌娢绝对不会相信这是可以猜到的东西。“如果你乐意这样想，我不介意。” 韩哲轩摊开双手，还是一副漫不经心的样子。“那看来是我想错了，你是怎么知道的？”“猜得。”“哦，原来是这样 啊”慕容凌娢表面上笑着说，心里却在告诫自己，冷静一定要冷静，不能着急，不能生气这算是答复吗？ 太敷衍了吧！不想告诉我就直说吗，真是烦人。韩哲轩最终也没有告诉慕容凌娢他是怎么知道她的真实姓名的，因为这 个话题很快就被百蝶机智的转移了，她可不想看着两个人如此尴尬的僵持在大街上，毕竟这样太引人注意了。“凌娢， 你不是觉得饿了吗？赶快走吧。”百蝶拉着慕容凌娢的胳膊便将她向前拖去，强行拉开了她和韩哲轩的距离。“就是， 如果为了那种小事而饿死在大街上可就划不来了。”要不是被百蝶拉着，慕容凌娢早就扑上去把韩哲轩暴打一顿了，尤 其是他那张好看但欠揍的脸，总是笑得让人很不爽。不过话说回来，那个高度对她来说可能不太好触碰。“要不是害怕 胳膊疼，我早就把你的脸打成猪头了！”就算打不成，气势