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1、食品蛋白质的测定,20130809,一、测定意义 蛋白质是生命的物质基础,蛋白质是食品重要的营养指标。 二、测定方法凯氏定氮法 多种方法来测定食品中的蛋白质含量,如凯氏定氮法、水杨酸比色法、紫外分光光度法、Lowry法等。最基本、最常用、最可靠的方法是凯氏定氮法。,凯氏定氮法,1、原理 总氮含量，乘以转换系数，间接求出蛋白质含量。 2、凯氏定氮分类 分常量凯氏定氮法、半微量凯氏定氮法、微量凯氏定氮法。 按取样量（蒸馏时，所取样液相当于样品的量）：常量凯氏定氮法500mg；半微量凯氏定氮法100-500mg；微量凯氏定氮法10-100mg。 按所用装置：(图3-16,3-16,3-17,3-18
2、,常量凯氏定氮装置、微量凯氏定氮装置,半微量凯氏定氮 装置,凯氏定氮法方法提要,凯氏定氮法测定蛋白质含量分四步：即消化、蒸馏与吸收、滴定、计算。 (1)消化 消化反应 消化装置(3-16,3-19),2）蒸馏与吸收,（3）滴定 指示剂：溴甲酚绿甲基红（5：1），酒红（酸式色）灰色（变色点）兰色（碱式色）； 次甲基蓝甲基红（1：2），紫红（酸式色）兰紫色（变色点）绿色（碱式色）。,（4）计算 其中：0.0141亳摩尔盐酸相当于氮的克数 M：标准盐酸的摩尔浓度。 W：每份样品的克数。,F：蛋白质换算系数，又称氮-蛋白质换算系数。 多数蛋白质换算系为数6.25。 不同的食品采用不同的换算系数。见下表
3、：,4、凯氏定氮法的特点及适用范围,（1）费时，操作复杂；测定食品蛋白质的最准确的方法，作标准方法；半自动化、全自动化阶段。 （2）本法测定的为粗蛋白 非蛋白氮 纯蛋白质的定量 （3）消化用H2SO4，不用HNO3和HClO4 。,食品脂肪的测定,20130809,测定脂肪的意义,食品中的脂肪主要包括脂肪（甘油三酸酯）类脂化合物（脂肪酸、糖酯和甾醇）。脂肪是食品中具有最高能量的营养素，也是事物中的三大营养素之一，食品中脂肪含量的高低是衡量食品营养价值的指标之一。在食品加工生产过程中，加工的原料、半成品、成品的脂类含量对食品的风味、组织结构、品质、外观、口感等都有重要影响。,测定脂肪方法,（一）
4、 *索氏提取法 （二）酸水解法 （三）*罗紫-哥特里法（碱性乙醚提取法） （四） 巴布科克法和盖勃法 （五）氯仿甲醇提取法 过去测定脂肪普遍采用的是索式提取法，这种方法至今仍被认为是测定多种食品脂类含量的代表性的方法，但对于某些样品测定结果往往偏低，而巴布科克法、益勒式法、罗斯-哥特里法主要用于乳、及乳制品中脂类的测定，而酸水解法测出的脂肪为游离态脂和结合脂全部脂类。,适用范围与特点,索氏提取法适用于脂类含量较高，结合态的脂类含量较少，能烘干磨细，不宜吸湿结块的样品的测定。 此法只能测定游离态脂肪，而结合态脂肪无法测出，要想测出结合态脂肪需在一定条件下水解后变成为游离态的脂肪方能测出。 另外此
5、法是经典方法，对大多数样品结果比较可靠，但需要周期长，溶剂量大。,提取常用试剂及其特点,乙醚：溶解能力强，沸点低（34.6），易燃， 可含约2%的水分。因含水乙醚会同时抽出糖分等成 分，所使用时，必须采用无水乙醚作提取剂，且待 测样品应无水分。乙醚不能溶解结合态脂肪。 石油醚：溶解能力比乙醚弱，沸程3545，无 乙醚易燃，吸水比乙醚少，也不能提取结合态脂肪。 氯仿甲醇混合液：价格高、毒性强、对脂蛋白、 磷脂提取效率高。,罗紫哥特里法GB5413.3第一法,此法为国际标准化组织（ISO），联合国粮农组织/世界 卫生组织（FAO/WHO）等采用，为乳、炼乳、奶粉、 奶油等脂类定量的国际标准法。它适
6、用于各种液状乳 （生乳、加工乳、部分脱脂乳、脱脂乳等）、各种炼乳、 奶粉、奶油及冰淇淋。除乳制品外，也适用于豆乳或加 工成乳状的食品。 本法适用于能在碱性溶液中溶解或至少能形成均匀混 悬胶体的样品，是乳品脂肪测定公认的标准方法,乳是多种物质组成的混合物，它不是简单的分散体系，而是具有胶体特性的多种分散体系。故在乳脂类测定中，用有机溶剂不能直接提取，而必须先行破坏胶体状态进而破坏脂肪球膜，使脂肪游离，再用有机溶剂进行提取、定量。,1、原理 罗紫哥特里法的原理是利用破坏乳的胶体性状及脂肪球膜，使非脂成分溶解于氨-乙醇溶液中而脂肪游离出来，再用乙醚-石油醚提取出脂肪，蒸馏去除溶剂后，残留物即为乳脂。
7、,2、仪器,恒温水浴（60-700C和1000C） 毛氏抽脂瓶 电热恒温烘箱（80-120）,3、 试剂 250g/L氨水（相对密度0.91） 95%（体积分数）乙醇 乙醚：不含过氧化物 石油醚,4、操作步骤,氨-乙醇处理 乙醚-石油醚提取 回收溶剂,（1）仪器准备 恒重三角瓶， （2）抽提 称取乳粉1克左右（或牛奶10克），放入毛氏抽脂瓶中，乳粉加入10ml 50-550C的水，混匀。加入2ml 氨水，充分混合后立即放入6550C的水浴中，加热15-20分钟。取出毛氏抽脂瓶，冷却至室温。加入10ml乙醇，缓和并彻底混合，加入两滴刚果红，再加入25ml乙醚振摇1min，再加入25ml石油醚，震
8、荡30秒.静至30min，待分层清晰后，将有机层倒入至已恒重的接受瓶中。再加乙醚、石油醚（2-3次）的重复提取（每次用15ml），将有机层合并于同一接受瓶中。,（3）蒸发溶剂、烘干、称重 将接受瓶放置1000C水浴中蒸去醚液后，置于100-1050C 烘箱干燥2小时，取出置干燥器中，冷却室温后称量，反复 操作直至恒重。m2 5、结果计算 m2m1 粗脂肪（%）= x 100 m样 m2接受瓶和脂肪的质量，g m1接受瓶质量，g m样样品质量，g,巴布科克法和盖勃法,1、原理,用浓硫酸溶解乳中的 乳糖和蛋白质等非脂成 分，将牛奶中的酪蛋白钙 盐转变成可溶性的重硫酸 酪蛋白，使脂肪球膜被破 坏，脂
9、肪游离出来，再利 用加热离心，使脂肪完全 迅速分离，直接读取脂肪 层的数值，便可知被测乳 的含脂率。,2、适应范围与特点,这两种方法都是测定乳脂肪的标准方法， 适用于鲜乳及乳制品脂肪的测定。对含糖多 的乳品（如甜炼乳、加糖乳粉等），采用此 方法时糖易焦化，使结果误差较大，故不适 宜。 此法操作简便，迅速。对大多数样品来说 测定精度可满足要求，但不如重量法准确。,3、仪器, 巴布科克氏乳脂瓶：颈部刻度有0.08.0%，0.010.0%两种，最小刻度值为0.1%， 盖勃氏乳脂计：颈部刻度为0.08.0%，最小刻度为0.1% 乳脂离心机 盖勃氏离心机 标准移乳管 4、试剂 硫酸：相对密度1.8160
10、.003（20C），相当于9091%硫酸 异戊醇： 相对密度0.8110.002（20C）， 沸程128132C。,5、测定方法 精密吸取17.6mL样品，倒入巴布科克氏乳脂瓶中，再取17.5mL硫酸，沿瓶颈缓缓注入瓶中，将瓶颈回旋，使液体充分混合，至无凝块并呈均匀棕色。置乳脂离心机上，以约1000r/min的速度离心5min，取出，加入80C以上的水至瓶颈基部，再置离心机中离心2min，取出后再加入80C以上的水至脂肪浮到2或3刻度处，再置离心机中离心1min，取出后置5560C水溶中，5min后立即读取脂肪层最高与最低点所占的格数，即为样品含脂肪的百分数。,6、说明及讨论 硫酸的浓度要严格
11、遵守规定的要求，如过浓会使乳 炭化呈黑色溶液而影响读数；过稀则不能使酪蛋白完全溶 解，会使测定值偏低或使脂肪层混浊。 硫酸除可 破坏脂肪球膜，使脂肪游离出来外，还可 增加液体相对密度，使脂肪容易浮出。 盖勃法中所用异戊醇的作用是促使脂肪析出，并能 降低脂肪球的表面张力，以利于形成连续的脂肪层。 加热（6570C水浴中）和离心的目的是促使脂肪 离析。, 巴布科克法中采用17.6ml标准吸管取样，实际上注入巴 氏瓶中的样品只有17.5ml，牛乳的相对密度为1.03，故样品重 量为17.51.03=18g。巴氏瓶颈的刻度（010%）共10个大 格，每大格容积为0.2ml，在60C左右，脂肪的平均相对
12、密度 为0.9，故当整个刻度部分充满脂肪时，其脂肪重量为 0.2100.9=1.8g。18g样品中含有1.8g脂肪，即瓶颈全部刻度 表示为脂肪含量10%，每一大格代表1%的脂肪。故瓶颈刻度 读数即为样品中脂肪百分含量。 每组样品只取两格乳脂瓶进行测定。放入离心机时，必 须对称放置。 硫酸的浓度和用量必须严格按照规定，沿瓶壁缓慢加 入，回旋摇动，使充分混合 ，否则易时脂肪层产生黑色块粒。,氯仿-甲醇提取法索氏提取法对包含在组织內部的脂肪等不能完全提取出来，酸分解法常使磷脂分接而损失。而在一定的水分存在下，极性的甲醇及非极性的氯仿混合溶液却能有效地提取结合态脂类，如脂蛋白、蛋白脂等及磷脂，此法对于
13、高水分生物试样如鲜鱼、蛋类等脂类的测定更为有效。,1、原理,氯仿-甲醇提取法的原理是将试样分散于氯仿-甲醇混合液中，于水浴上轻微沸腾，氯仿-甲醇混合液与一定的水分形成提取脂类的有效溶剂，在使试样组织中结合态脂类游离出来的同时与磷脂等极性脂类的亲合性增大，从而有效地提取出全部脂类。再经过滤，除去非脂成分，然后回收溶剂，对于残留脂类要用石油醚提取，定量。,2、仪器, 具塞三角瓶 电热恒温水浴：501000C 提取装置 布氏漏斗：11G-3，过滤板直径40mm，容量60100mL 具塞离心管 离心机：3000r/min。,3、试剂, 氯仿：97%（体积分数）以上。 甲醇：96%（体积分数）以上。 氯
14、仿甲醇混合液：按2：1体积比混合。 石油醚。 无水硫酸钠：以1201350C干燥12h。,4、操作步骤, 提取 准确称取均匀样品5g于具塞三角瓶内（高水分食品可 加适量硅藻土使其分散），加入60mL氯仿-甲醇混合液（对 于干燥食品，可加入23mL水）。连接提取装置，于650C水 浴中，由轻微沸腾开始，加热1h进行提取。 回 收溶剂 提取结束后，取下烧瓶用布氏漏斗过滤，并用氯仿-甲 醇混合液洗涤滤器，烧瓶及滤器中试样残渣，滤液、洗涤液 一并收集于具塞三角瓶内，置65700C水浴中回收溶剂，至 烧瓶内物料呈浓稠态，而不能使其干，然后冷却。, 石油醚萃取、定量 用移液管加入25ml石油醚，然后加入1
15、5g无水硫 酸钠，立即加塞混摇1 min ，将醚层移入具塞离心沉淀管进行离心分离（3000r/min）5min.用10mL移液管加入迅速吸取离心管中澄清的石油醚10mL,于已称量至恒量的干燥称量瓶内，蒸发去除石油醚，于1001050C烘箱中烘至恒量（约30 min ）。,5、结果计算,（ m2m1）x 2.5 总脂肪（%）= x 100 m,m-试样质量，g; m2-称量瓶与脂类质量，g; m1-称量瓶质量，g; 2.5-从25mL乙醇中取10mL进行干燥，故乘以系数2.5。 6、本法适用范围：结合态脂肪类的食品（鱼 .大豆类）,乳和乳制品中非脂乳固体的测定,GB 5413.392010,1
16、范围,生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳、调制乳、发酵乳中非脂乳固体的测定方法,2 原理,先分别测定出乳及乳制品中的总固体含量、,脂肪含量,（如添加了蔗糖等非乳成分含量，,也应扣除）,，,再用总固体减去脂肪和蔗糖等非乳成分含量，即为非脂乳固体。,先分别测定出乳及乳制品中的总固体含量、,脂肪含量,（如添加了蔗糖等非乳成分含量，,也应扣除）,，,再用总固体减去脂肪和蔗糖等非乳成分含量，即为非脂乳固体。,先分别测定出乳及乳制品中的总固体含量、脂肪含量（如添加了蔗糖等非乳成分含量，也应扣除），再用总固体减去脂肪和蔗糖等非乳成分含量，即为非脂乳固体。,试剂和材料,平底皿盒：高20 mm25 mm，直径50 mm7
17、0 mm的带盖不锈钢或铝皿盒，或玻璃称量皿。,短玻璃棒：适合于皿盒的直径，可斜放在皿盒内，不影响盖盖。,石英砂或海砂：可通过500 m孔径的筛子，不能通过180 m孔径的筛子，并通过下列适用性测试：将约20 g的海砂同短玻棒一起放于一皿盒中，然后敞盖在100 2 的干燥箱中至少烘2 h。把皿盒盖盖后放入干燥器中冷却至室温后称量，准确至0.1 mg。用5 mL水将海砂润湿，用短玻棒混合海砂和水，将其再次放入干燥箱中干燥4 h。把皿盒盖盖后放入干燥器中冷却至室温后称量，精确至0.1 mg,两次称量的差不应超过0.5 mg。如果两次称量的质量差超过了0.5 mg，则需对海砂进行下面的处理后，才能使用
18、： 将海砂在体积分数为25 %的盐酸溶液中浸泡3d，经常搅拌。尽可能地倾出上清液，用水洗涤海砂，直到中性。在160 条件下加热 海砂4 h。然后重复进行适用性测试,仪器和设备,天平：感量为0.1 mg,干燥箱。 水浴锅。,分析步骤,总固体的测定,在平底皿盒中加入20 g石英砂或海砂（4.3），在100 2 的干燥箱中干燥2 h，于干燥器冷却0.5 h，称量，并反复干燥至恒重。称取5.0 g（精确至0.0001 g）试样于恒重的皿内，置水浴上蒸干，擦去皿外的水渍，于100 2 干燥箱中干燥3 h，取出放入干燥器中冷却0.5 h，称量，再于100 2 干燥箱中干燥1 h，取出冷却后称量，至前后两次
19、质量相差不超过1.0 mg。,试样中总固体的含量按式（1）计算：,式中： X试样中总固体的含量，单位为克每百克（g/100g）； m1皿盒、海砂加试样干燥后质量，单位为克（g）； m2皿盒、海砂的质量，单位为克（g）； m试样的质量，单位为克（g）。,脂肪的测定（按GB 5413.3中规定的方法测定）。,蔗糖的测定（按GB 5413.5中规定的方法测定）。,XNFT=X-X1-X2(2) 式中： XNFT试样中非脂乳固体的含量，单位为克每百克（g/100g）； X试样中总固体的含量，单位为克每百克（g/100g）； X1试样中脂肪的含量，单位为克每百克（g/100g）； X2 试样中蔗糖的含量，单位为克每百克（g/100g）。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。,分析结果的表述,42,