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1、血液细胞化学染色检测方法与应用,Shi Qing,概述,细胞化学染色是在组织化学的基础上发展起来的一个学科分支，是细胞学与化学相结合而形成的一门科学，研究细胞的化学成分，在保存血液细胞形态的基础上，在细胞原位显示化学反应的结果，根据化学反应的原理，研究细胞成分的化学性质。,研究目的及临床应用,研究正常血液细胞的活动与生理功能 提高血液病的诊断和鉴别诊断水平 确定急性白血病的类型 有助于某些血液病的鉴别诊断 观察疗效和估计预后 探索某些血液病的发病原理及治疗机制,标本的选择,BM片、血片、淋巴结印片、脾印片等均可作组化染色。 用于酶染色的标本应尽可能新鲜。 用于非酶染色的标本可在室温下放置1个月
2、，如PAS标本。,固定的目的及方法,目的 保持细胞生前的结构与化学成分，并使血膜在染色、冲洗过程中不易脱落损坏。 常用化学固定方法 甲醛蒸汽固定：将滤纸平铺于染色缸底部，加入少许40%甲醛溶液。将涂片标本放入缸内，加盖使甲醛蒸汽固定血膜5-10分钟，水洗后晾干。 液体固定：常用的固定液为乙醇、丙酮、甲醇、甲醛等，也可用两种或两种以上成分组成混合固定液。,显示方法,纯化学方法 金属沉淀法 偶氮偶联法 联苯胺色素法 Schiff反应 普鲁士蓝反应 类化学方法 物理学方法,复染方法,复染是细胞内化学成分显色后，为了便于观察而进行的对比染色方法。 细胞核复染法：常用染料为苏木精、甲基 绿、核固红、沙黄
3、等。 细胞浆复染法：常用染料为伊红、光绿等,过氧化物酶染色（Peroxidase stain, POX）,目的,急性白血病的鉴别诊断 AML：阳性 ALL：阴性,分布特点-1,原粒细胞：阴性，白血病副原粒细胞可呈阳性反应。 中性粒细胞：自早幼粒细胞起随细胞成熟阳性强度递增。阳性颗粒圆形，规则，直径与嗜苏丹黑颗粒相仿，比瑞氏染色特殊颗粒大。 嗜酸粒细胞：阳性反应，颗粒比中性粒细胞的 大，着色深。 嗜碱粒细胞：阴性反应，在CML时可出现阳性反应。,分布特点-2,在粒细胞系统中，过氧化物酶颗粒的出现和增多与特殊颗粒 的出现和增多有平行关系。 单核细胞系：原单呈阴性反应，幼单和单核细胞呈弱阳性反应。阳
4、性颗粒少而细小，弥散分布，有的也可呈阴性反应。 其他细胞：淋巴细胞、巨核细胞、血小板、幼红细胞、浆细胞和组织细胞均呈阴性反应。有的吞噬细胞可呈阳性反应,试剂配制,0.3%联苯胺酒精溶液： 联苯胺0.3g+95%乙醇全溶后，加入亚硝 基铁氰化钠饱和水溶液1ml。可保存1-2年。 过氧化氢溶液配制： 3%过氧化氢1滴+蒸馏水5ml，须每次用时新鲜配制。,染色步骤,于新鲜涂片上滴加复方联苯胺染液38滴，使涂片盖满。 12分钟后加入等量过氧化氢溶液。 48分钟后用水冲洗，空气中晾干。 用瑞氏染液复染，凉干后油镜观察。,染色原理,粒细胞及部分单核细胞胞浆内的颗粒中含有过氧化物酶，该酶能分解过氧化氢，释放
5、出新生态的氧。从而使无色的联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝。 联苯胺蓝是一种不稳定的中间产物，它可进一步氧化变成棕色的化合物,结果判断,阳性反应为蓝色或蓝棕色颗粒，定位于胞浆中。,临床意义,ALL时，原始细胞的POX阳性小于3%。 AML时，原始细胞的阳性3%。 在多数的M1、绝大部分M2和M3中，原始细胞的阳性率大于85%。M4和M5时，原单有时可呈弱阳性，但绝大多数的原单是POX阴性。M6，原粒和幼稚粒细胞是POX阳性，幼红细胞是POX阴性。在M7，血小板POX的活性只能在超微结构上证实。 MDS时，粒细胞白血病和感染所致的WBC增高时，成熟中性粒细胞的POX活性可能降低或消失。 CML时，成熟
6、中性粒细胞的POX活性增强。,注意事项,已固定的血膜因为酶已破坏不能再作过氧化物酶染色。 所用过氧化氢必须新鲜，加于血膜上应能发生泡沫。过量时红细胞可出现假阳性。 过氧化氢的浓度要适当加减，过量则颗粒色深，不足则颗粒色淡。 滴加过氧化氢液之后，最好将染片置于载物台上，用低倍镜观察，发现胞浆出现阳性颗粒时，立即水洗。,糖原染色 （Periodic acid-Schiff reaction, PAS）,目的,红白血病（+）与巨幼红细胞贫血（- ）的鉴别诊断 MDS与巨幼红细胞贫血（- ）的鉴别诊断 单核细胞白血病（+）与组织细胞病（MH）的鉴别诊断 淋巴肉瘤、何杰金病与急性淋巴细胞白血病的鉴别诊断
7、 高歇病与尼曼- 匹克病的鉴别诊断 以上都是前者增高，后者降低或阴性。,试剂 -1,10g/L过碘酸液 Schiff染液： 碱性品红 0.5g DH2O 100ml DH2O煮沸后待片刻，加入碱性品红，振荡数分钟使品红溶解，冷至50加入1M的盐酸20ml，混匀。待冷却至25加入偏重亚硫酸钠0.5g，混合，置于带塞的棕色瓶中，放于暗处24小时。染液为无色，如为微红则加活性炭12g，混合过滤，如过滤液仍有红色，应再加少许活性炭，至红色完全被吸收为止。制成后置于棕色瓶内保存在冰箱备用，如变为红色，则不能使用。,试剂-2,苏木素液： 苏木素 0.9g 95乙醇 10ml 铵（钾）明矾 20g DH2O
8、 200ml 将苏木素溶于95的乙醇，钾明矾溶于水（可加热），然后将苏木素液加入明矾液中混合，用强火煮沸后加氧化汞0.5g，迅速搅拌，呈深紫色，迅速移入冷水中，次日过滤，临用时取此液95ml加冰醋酸5ml，可使细胞着色清楚。,染色步骤,将新鲜血片或骨髓片用95乙醇固定10分钟。 10g/L过碘酸液作用20分钟 DH2O洗涤1分钟，晾干 Schiff染液，60分钟 用自来水洗涤15分钟（细水长流冲洗） 苏木素染液10分钟。 自来水冲洗15分钟，待干镜检。,染色原理,过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成二醛，再与Schiff氏液的无色品红结合，呈红色，定位于胞浆上。,结果判断,正常BM：有核红细胞
9、几乎均呈阴性反应，在AMLM6，幼红细胞为PAS强阳性。 中性粒细胞：原粒细胞多为阴性，早幼粒阶段开始呈PAS阳性，其后各阶段阳性逐渐增强。 巨核细胞和血小板：不含糖原，但含粘多糖等，故巨核细胞为细小弥散的阳性，PLT为粉红色。 ALL：可以是密集粗块状的颗粒，也能是细小弥散的颗粒，或是这两种颗粒的混合。ALL的PAS也可能为阴性，特别是L3时。 单核细胞白血病，原单细胞常为阴性，幼单和成熟单可有弱阳性或弥散阳性。,注意事项,1） Schiff液变红不能再用。 2） 碱性品红的质量很重要，如碱性品红不合格，加活性炭，颜色也不被吸附。 如无苏木精复染液，可用1%甲绿复染25分替代。,非特异性酯酶
10、染色,原理,非特异性酯酶是作用于短链脂肪的酶，当酯酶活性存在时，水解基质中的醋酸萘酚，与重氮盐偶联，生成不溶性的有机产物，定位于胞浆上。,试剂,甲醛： 基质液： 1/15M的磷酸缓冲液 PH7.4 40ml 10g/L 醋酸萘酚50丙酮液 0.8ml 重氮盐（Diazo blue B） 40mg,方法,新鲜涂片用甲醛蒸汽固定5分钟。 流水冲洗5分钟，晾干。 置于基质液中371小时，水洗泡10分钟。 20g/L甲绿复染2030分钟。 水洗，晾干，镜检。,临床意义,单核细胞系统呈阳性，伴随着细胞的成熟而加强，对AL有鉴别诊断作用。,非特异性酯酶-氟化钠抑制试验,同非特异性酯酶，只是在1ml作用液中
11、，加入1.5mg 氟化钠，即可抑制单核细胞的酯酶，故可作急性单核细胞白血病的鉴别诊断。,急性白血病中的组化染色,白血病 POX NSE PAS ALL + + AML M0 + M1 + (3原始细胞) M2 + M3 + + M4 + +（原单细胞） M5 /+ + /+ M6 +（原粒细胞） +（幼红细胞） M7 + +,中性粒细胞碱性磷酸酶染色（AKP）,目的,鉴别白血病（低）和白血病样（高）反应 鉴别淋巴肉瘤（高）和何杰金病 鉴别细菌性感染（高）与病毒性感染,分布,血细胞的碱性磷酸酶活性，主要见于成熟的中性粒细胞，定位于胞浆中。,原理,细胞中的AKP在PH9.59.6缓冲液中能使基质中
12、的磷酸萘酚钠水解，释放出萘酚。后者与一种稳定的重氮盐（常用有固紫Fast-Garnet，GBC或固蓝RR）偶联，生成不溶性的偶氮染料，沉积于细胞上。,试剂,95%乙醇 固酱紫GBC AS-BI磷酸萘酚12.5mg + DH2O100ml 0.2M tris缓冲液：三羟甲基氨基甲烷2.43g+DH2O溶至100ml。 0.05M tris 缓冲液（PH8.6-9.0）：0.2 M tris 缓冲液25ml+ 0.1M HCL 49ml 贮存液：50ml AS-BI磷酸萘酚+PH8.8 0.05Mtris缓冲液50ml混匀，冰箱保存 1%甲基绿,染色步骤,新鲜BM片及血片待干 95%乙醇固定10分
13、钟 固酱紫1mg + 2ml贮存液混匀，立即滴加数滴在血片或BM片上，置37孵箱孵育30分钟 用蒸馏水快冲 放入1%甲绿中复染5分钟 用蒸馏水快冲，待干，镜检,结果判断,阳性颗粒呈红色，定位于成熟中性粒细胞胞浆 内。 计数方法，按碱酶活性强弱，分为0-4+共5级。 分数 特点 0 胞浆内无红色的颗粒 1 弥散的红色，偶见颗粒 2 弥散的红色，有中等量的颗粒 3 显著的红色，有较多的颗粒 4 显著的红色，有充满胞浆的粗大颗粒,计算积分,分数 细胞数目 积分 0 20 0 1 45 45 2 25 50 3 5 15 4 5 20 总数 100 130=LAP积分,临床意义,正常的LAP积分是20
14、100分，但因为计数的主观性，很重要的是建立每个实验室自己的正常值。 临床诊断 积分 正常 20100 CML 13 类白血病 100 真红 100200 继发性红细胞增多 10100,铁粒染色,原理,骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其中的三价铁与分子中的蛋白质结合不牢，经稀盐酸处理后而游离出来，并能在酸性亚铁氰化钾溶液中产生普鲁士蓝反应。细胞内铁也可用此法显示。根据反应的强弱了解骨髓中铁的含量。,试剂,酸性亚铁氰化钾溶液： 200g/L亚铁氰化钾溶液 5份 浓盐酸 1份 取200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓加入浓盐酸，边滴加边摇匀，至出现白色沉淀，再滴加200g/L亚铁氰化钾，边滴
15、加边摇匀，至白色沉淀消失为止，备用。 2g/L核固红硫酸铝溶液：取硫酸铝10g加入100ml DH2O再加入核固红EMER出品 0.2g，置于37水浴中1小时，并经常振荡，使溶解，过滤后使用。,方法,选骨髓小粒丰富的骨髓涂片 玻片上滴加酸性亚铁氰化钾，染色30分钟。（可置于37） 用DH2O冲洗后用核固红染液复染1015分钟。 流水冲洗，晾干，油镜检查。,结果,正常人细胞外铁： 幼红细胞呈鲜红色，胞浆成淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。 细胞外铁的判断用低倍镜观察涂片，特别时涂片尾部和骨髓小粒附近。,细胞外铁判断标准, 无颗粒 有少数铁颗粒或偶见铁小珠 有较多的铁颗粒和小珠 有很多的铁颗粒，小珠和少数小
16、块状 有极多的铁颗粒，小珠并有很多的 小块，密集成堆,铁粒幼红细胞的分型,1型 仅含一个铁颗粒 2型 含25个铁颗粒 3型 含69个铁颗粒 4型 含10个以上的铁颗粒,环形铁粒幼细胞,含铁颗粒6个以上，其中2/3以上的铁颗粒围绕核周围排列成完全环形或不完全环形（围绕核周围指分布紧靠着细胞核或靠近细胞核的1/3胞浆内，铁颗粒增多时，可分布于外2/3的胞浆内。,临床意义,IDA：骨髓细胞外铁和内铁显著减少或消失，铁粒幼红细胞阳性率为016，铁颗粒极少并着色浅，以1型为主，2型者极少，3型以上者不见。经铁剂治疗后细胞外铁和内铁可迅速增多，因此是诊断IDA和指导铁剂治疗的一种辅助方法。,是诊断铁粒幼红细胞贫血的重要依据，能发现数量不等的环状铁粒幼红细胞，并且多见粗颗粒的3型和4型铁粒幼红细胞。,注意事项,玻片必须经无铁处理：将新玻片经清洁液浸泡24小时，取出后反复水洗浸入95酒精24小时，晾干，再浸泡在5盐酸中24小时，用D2H2O反复洗玻片，取出烤干后备用。 酸性亚铁氰化钾液必须新鲜配制。 最好用骨髓小粒丰富的骨髓涂片进行染色并作细胞外铁观察。,