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1、毛细管电泳,Capillary Electrophoresis,目录,1、毛细管电泳的基本概念和原理 2、毛细管电泳的分离模式与特点 3、毛细管电泳在药物分析中的一些应用 4、毛细管电泳应用热点 5、毛细管电泳新技术 6、毛细管电泳发展方向,毛细管电泳 capillary electrophoresis 是利用被分析离子在电场作用下移动的速率不同而达到分离的目的，,概 念,特 点,瑞典化学家Tiselius建立了“移界电泳”，成功地将人血清中的蛋白质分为5个主要成分，为蛋白质化学的发展奠定了基础。,毛细管电泳的基本原理,离子的电泳迁移率不同，在电场中移动的速度不一样，利用这个原理可以把不同的离
2、子彼此分离。电泳迁移率与分析物质所带电荷呈正比，与摩擦阻力系数呈反比。如果两种物质带有不同的电荷或者通过缓冲溶液移动的摩擦力不同，那么这两种物质可以彼此分离。,毛细管电泳,1 离子移动的速率, = eE = eU/L,U是毛细管柱两端施加的压力 L是毛细管柱总长。 采用高电压可以达到使离子迅速移动和快速分离。,2 毛细管电泳中的板高,N = eU/2D,由于分离度随塔板数的增加而增加，因此为了获得高的分离度应采用高电压。 在凝胶板形电泳中，一般最高使用的电压约为500 V。 在毛细管电泳中，一般可采用20,000 60,000 V的高电压。,3 电渗流,当高电压通过含有缓冲溶液的毛细管柱时，管
3、内的溶质向阴极或阳极移动，产生电渗流。在柱内层氧化硅与溶质的界面上形成双电层是电渗流产生的原因。,毛细管电泳装置,一般在一根长 40 100 cm, 内径 10 100 m 的毛细管柱中充入缓冲溶液，柱的两端置于两个缓冲池中。在两个缓冲池之间的毛细管接有两个铂电极。试样从一端进入，而检测器则在另一端。使用的高电压可以反相，以能分析阴离子。,一般的进样方式是电动进样和压力进样。 电动进样是将毛细管柱的一端及其相应端的电极从缓冲池中移出，放入试样杯中，然后在一准确时间范围内施加压力，使试样因离子移动和电渗流进入毛细管柱。 压力进样是用压差使试样溶液进入毛细管。产生压差的办法可以采用在检测器端抽真空
4、，或者通过提高试样端液面。,毛细管电泳的分离模式,毛细管区带电泳 capillary zone electrophoresis, CZE 毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis, CGE 毛细管等速电泳 capillary isota- chophoresis, CITP 毛细管等电聚焦 capillary isoelectric focus, CIEF,毛细管区带电泳,是基于试样中各个组分间荷质比的差异进行分离的。这种电泳模式的特征是整个系统都用同一种缓冲溶液充满。背景电解质的浓度一般高于试样，起运载电流的作用，其离子有一定的迁移率。当电流通过时，缓冲溶液
5、中的阴，阳离子分别以一特定的速度分别向正极和负极移动。,毛细管区带电泳可以分离小离子，而且能分离那些衍生化或反应生成离子的物质，如抗炎药物，氨基酸，蛋白质等物质。缺点是只能分析带电物质，对中性物质无能为力。,高效液相色谱是以高压为驱动，依据和组分在两相中的分配比例不同，进而达到分离的目的，正事因为是高压为驱动力，致使柱子内流体是以抛物线形式向前移动的。,区别一：驱动力不一同，柱内流型不同,高效液相色谱和毛细管区带电泳的两点区别,高效毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。在毛细管内液体流行时塞型。,因为高效液相
6、色谱和毛细管区带电泳柱内的液体流型不同，致使高效液相色谱的图谱比电泳的图谱的色谱带要宽。,可以清晰的看出，液相色谱的色谱图谱带药比电泳的宽许多，这也是电泳分离效率高的原因之一。,区别二：分离原理不同，致使分离物质不同,高效液相色谱适合分离沸点高的大分子物质，各物质在柱内随着流动相运动，而各物质和固定性之间的作用力不同，也就是说各组分在流动相和固定相之间的分配比不同，进而达到分离的目的。而毛细管区带电泳不能分离在缓冲溶液中的中性分子，只能分离在缓冲溶液中带点的物质。这是因为电泳柱子内壁形成了双电层，致使电泳柱子内壁带有负电荷，可以吸附阳离子，在电场力的作用下，阳离子整体向阴极移动，形成了电渗流，
7、从而使各物质之间分离开来。,电泳分离带电物质的原理图,毛细管凝胶电泳,是将生物大分子如蛋白质，DNA片断，按相对分子质量大小进行分离的一种分离方法。 毛细管凝胶电泳一般是在多孔的凝胶基质上进行，最常用的凝胶是在交联剂的存在下聚合丙烯酸酰胺。聚合物的孔穴大小取决于单体与交联剂的比例，增加交联剂的量可以得到小孔穴凝胶。,毛细管等速电泳,是基于试样中各组分电泳迁移率的差异而进行分离的。在等速电泳中试样是引入在两种不同的电解质之间，其中一种是迁移率较高的前导离子电解质溶液另一种是迁移率较低的尾随离子电解质溶液。当加上电场后，由于各种离子迁移率不同，向正极迁移的速度不同，故电解质溶液将形成由负极到正极增
8、加的离子浓度梯度，而电位梯度与电导率呈反比，故低浓度离子区即低电导区有较高的电位梯度。因此电泳池内电解质溶液的电位梯度有正极向负极增加。由于离子的迁移速度与电场强度呈正比，随着电泳的进行，离子进入等速状态，此时形成紧紧相邻而又彼此完全分离的单组分区带。,毛细管等电聚焦,是基于不同蛋白质或多肽之间等电点pH的差异进行分离。分子中既有酸性基团又有碱性基团的两性物质，如蛋白质，有一个等电点pI, 即电荷为零时的pH。当溶液中的pH正好是两性物质的等电点时，它们在电场中不移动。高于此pH时，它们失去质子带负电荷，在电场作用下向正极移动 低于此pH时，移向负极。若在毛细管柱中置一pH梯度缓冲溶液，从一端
9、向另一端递增。当两性物质，如蛋白质进入毛细管柱置于高于它的pI的地方，它就带负电荷，趋向正极 而朝这个方向pH逐渐变小，最后达到pH等于它的pI值的部位，此时净电荷为零，速度也为零。 通过等电点聚焦，将试样中不同物质浓缩在不同的等电点处，从而达到分离的目的。,电泳效率的影响因素,PH、电压、添加剂、缓冲液的选择及浓度、手性选择剂的选择及浓度、提取方式、电压及管长。 添加剂的添加,可以减少毛细管电泳的电渗流,降低焦耳热的产生,由此可以加大分离电压,提高分离度。,毛细管电泳在药物分析中的应用,（一）体内药物分析 1治疗药物监测（TDM） 2中毒与药物滥用监督 滥用药物种类多，结构相似，用CZE法不
10、易分离，文献报道多用MECC法，样品则有血清、尿、唾液等。 主要检测的滥用药物已有阿片生物碱、大麻酚类衍生物、苯丙胺、甲基苯丙胺及相应的代谢物。 3体液中手性药物的分离 目的是对手性药物的各个异构体进行分离，能更好地了解药效和安全用药，制定合理的给药方案，为剂量调整提供科学依据。,（二）药物成分分析,1化学药物及其制剂 能基本解决定性定量和纯度控制，但某些结构特异、性质特殊的品种仍有一定困难 2中药及中药制剂 可用于中药材的鉴别和标难品纯度检查，特别是4P“# 在指纹图谱鉴别天然药物的研究进展非常迅速，将提高中药的质量标准水平，逐步实现中药材、中成药质量标准的现代化 3手性药物的分离 对于药物
11、控制、对映体的生物活性和药理作用研究等方面有非常重要的意义。 4生化药品 5抗生素药品,CE应用热点,手性药物分离和纯度检验是药物研究和制药工业的关键任务，也是毛细管电泳在药物分析领域发展的重点。 如何选择适当的手性选择试剂以完成手性拆分是这类问题的关键。,一、手性分离,二、药物代谢研究,主要的方向： （1）药物的体内代谢 （2）体外代谢物组学研究 （3）药物在细胞、组织、体内整体传输 （4）药代动力学研究等 优势：如与色谱手性分离柱相比对生物样品中手性药品的分离显得更为经济、方便。 劣势：对生物样品进行前处理，解决基底干扰问题。,三、金属抗癌药物研究,主要研究对象涉及铂类、钌类等抗癌药物及其
12、代谢产物。 研究任务： 分离分析、生物药物稳定性评价、潜在抗癌金属药物和生物分子(核苷酸、DNA片断、DNA、氨基酸等)相互作用研究等分子相互作用研究。 研究多局限在模拟生理条件下，而直接涉及生物体内金属药物的代谢、生理转化过程和结合性质的研究还很少；另外，由于分析技术发展水平本身的制约，对生物基质(体液，癌细胞基质，组织提取液等)的研究也相对缺乏。 将来的研究方向很可能会从抗癌药物和DNA的相互作用研究扩展到药物和血液成分，如血清蛋白、白蛋白、脱铁转铁蛋白等大分子的相互作用。,研究可以从如下5种方法中选择： 1 区带毛细管电泳(CZE)、 2 亲和毛细管电泳(ACE)、 3 前沿分析法(FA
13、)、 4 HummelDreyer分析法(HD) 5 空峰法(VP)。 前沿分析法(FA)在相互作用研究中占有很大比例。FA主要应用于药物和生物分子间相互作用的研究，如用FA测定药物(华法林，维拉帕米，普萘洛尔)和血浆蛋白(人血清白蛋白，酸糖蛋白和脂蛋白)等相互作用。,四、分子相互作用研究,研究的相互作用体系则涉及到蛋白蛋白相互作用体系，蛋白一DNARNA作用体系，蛋白一碳水化合物作用体系，蛋白一小分子作用体系，DNA小分子作用体系，小分子一小分子作用体系。,毛细管电泳新技术,填充柱毛细管电色谱。它是利用电渗透驱动极性溶剂通过反相高效液相色谱毛细管柱，利用试样在两相的分配进行分离。 胶束电动毛
14、细管色谱。是在缓冲溶液中加入浓度高于胶束临界浓度的表面活性剂。胶束相在分离中起到了准固定相的作用，电中性的有机化合物按照它们在水相和有机相之间分配系数的差异进行分离。该方法也可用来改善带电有机化合物的分离选择性。,毛细管电色谱 是利用缓冲溶液的电渗流作为泵，使被分析的分子通过对其具有不同保留程度的第二相，达到分离的目的。,一、毛细管电色谱,分析对象： 扩展至蛋白、多肽类药物、中药复杂成分。其中柱(包括填充毛细管柱和柱塞)制备技术是CEC研究的一个重要领域，可以说该技术直接决定了CEC应用的广度。 主要有如下几类柱制备技术： 开管柱、填充柱、整体铸型(包括基于氧化硅的整体铸型、基于聚合物整体铸型
15、、基于粒子固定化的整体铸型)技术。 手性分离技术是CEC在近来发展中的一个重点。 在过去的几年里，发展用作对固定相修饰的手性选择剂成为该研究领域的焦点。如采用环糊精及其衍生物、手性蛋白质等固定相修饰技术。另外，分子印迹技术的发展给制备手性分离柱提供了全新的思路。,毛细管电动色谱的优点,像高效液相色谱，能够分离不带电荷的物质。 像毛细管电泳法，不需要压力泵系统的情况下，提供了微量体积试样溶液的高效分离通过电渗流泵，而不是通过机械输送流动相通过固定相的。明显地简化了输送体系。 电渗泵产生的是塞子式流动轮廓，而不是流体动力学轮廓，因此毛细管电色谱的分离柱效比高效液相色谱法高。,二、微芯片毛细管电泳技
16、术,微芯片毛细管电泳技术的特点为微型化、高效性从而显示了巨大的发展潜力，其制作技术(包括一系列的接口技术)也不断成熟。 关键问题仍集中于微型化、集成化、高通量和接口设计等几个方面。 应用：有文献记载在微芯片上采用MEKC模式高效分离了FITC标记的氨基酸对映异构体.,发展方向,发展趋势还会集中在上述的4个方面； 分析对象则会由简单模拟生命体系逐步扩展到包括体液、细胞、组织等在内的复杂生物样品体系。 生物样品分析必然要求进一步发展复杂样品前处理和富集技术、更灵敏的检测技术及与质谱联用出现的一系列问题，如接口技术、样品利用率、浓度灵敏度、检测波动性。 此外，CEC和微芯片毛细管电泳以其经济、微型、
17、高效的优势将在今后的发展中逐步占据更大的比例，成为推动毛细管电泳技术迈向常规检测技术的重要力量。,References,1.刘翔 and 赵炽彬, 高效毛细管电泳法在体内药物分析的应用. 中国卫生产业, 2011(6): p. 108-110. 2.王婧菲, 高效毛细管电泳技术在药物分析中的应用. 黑龙江科技信息, 2010(16): p. 20. 3.叶雅沁 and 郡雪梨, 毛细管电泳在体内药物分析中的应用. 海峡药学, 2010. 22(4): p. 64-66. 4.祝宝福, 解育静 and 杜学勤, 高效毛细管电泳在手性药物分析中的应用. 广东化工, 2009. 36(4): p.
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