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1、第九章 植物脱毒技术 宜职院08.9,目的与要求 了解脱毒意义，学习植物茎尖脱毒原理及其操作程序，了解其他组织脱毒方法及应用，掌握植物理化脱毒方法。学习植物脱毒苗的鉴定方法，掌握各方法的鉴定原理，了解植物脱毒苗的保存和繁殖方法。 具备植物茎尖脱毒技术基础，具有指示植物鉴定脱毒苗的基本能力，有脱毒苗保存的认知。,全世界已发现植物病毒有近788种。 病毒的危害： 组织和细胞病变 新陈代谢等生理机能受到干扰 外观表现不正常状态 由于危害可通过营养体传给后代，病毒对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产，甚至全株死亡。世界作物生产中，病毒危害程度仅次于真菌。,危害一些植物的病毒数目,所谓脱毒就是采用
2、一定的方法除去植物体内病毒的技术。 无病毒苗：指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现阴性反应的苗木。,应用植物脱毒技术意义 植物脱毒技术可使植物恢复原来优良特性，生长势增强，明显提高产量、改善品质，产量的提高幅度最高可达300%。 植物脱毒技术不仅脱除了病毒，还可以去除多种真菌、细菌及线虫病害，使种性得以恢复，植株生长健壮，减少肥料和农药施用量，降低生产成本，保护了环境,第一节 脱毒方法,一、茎尖培养脱毒 （一）通过茎尖培养脱毒的原理 1、病毒在植物体内的分布 病毒浓度不同，离尖端越远病毒浓度越高。茎尖或根尖，离体培养便可获得无病毒再生植株。 2、茎尖大小与脱毒 茎
3、尖外植体的大小与脱毒效果成反比。茎尖分生组织不能合成自身需要的生长素，但下部叶原基能提供，因而带叶原基的茎尖生长快，成苗率高。但茎尖越大，脱毒效果差。,（二）茎尖脱毒方法 1、取样与消毒 可直接选定的植株上取顶芽进行消毒接种。采顶芽与侧芽消毒接种 。 消毒方法是：剪取顶芽梢段3、5厘米，剥去大叶片，用自来水冲洗干净，在75%酒精中浸泡30秒左右，用1%-3次氯酸钠或5%-7%的漂白粉溶液消毒10-20分，最后用无菌水冲洗材料4-5次。,酒精擦拭手,外植体消毒,浸泡5min,器械消毒,酒精灯灼烧,酒精擦拭培养皿,2、茎尖剥离和接种 将已消毒的芽放在带滤纸的培养皿上器械固定解剖镜下剥去幼叶切下带1
4、-2个叶原基的生长点（0.3-0.5mm）切下的茎尖转至培养基上（顶部向上）。,酒精擦拭,旋转灼烧,显微镜下获取茎尖,接种,盖好瓶塞,脱毒马铃薯试管苗,3培养 25+2 ，1500-5000LX，10-16h 一般光照培养比暗培养效果好。其间应更换新鲜培养基。提高培养基中BA的浓度可形成大量从生芽。 4生根诱导 诱导生根的方法是将2-3cm高的无根苗转入生根培养基继续培养1-2个月可生根。,（三）培养基与培养方式 1、培养基：MS， White , Morel等 2、培养方式：一般采用半固体培养基。 （四）影响茎尖脱毒效果的因素（茎尖脱毒技术的关键） 植物种类、病毒种类、剥离茎尖的大小（0.3
5、-0.5mm带1-3个叶原基）、培养基营养,用于脱毒的适宜茎尖大小,二、热处理脱毒 脱毒原理 即热处理脱毒，一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下（35-40度）即钝化失活。 1、温汤浸渍处理脱毒法 材料置于50左右热水中浸渍几十分钟到数小时。 特点：简单易行，成本低，但易使材料受伤。适用：甘蔗、木本植物和休眠器官的处理。 2、热空气处理脱毒法 将植物用3540的热空气处理24周或更长时间。 特点：损伤较小，操作简便，须严格控制温度时间 适用：多数植物,3、热处理结合茎尖培养脱毒 目前常采用将热处理和茎尖分生组织培养结合起来的方法脱毒。 特点：既可缩短热处理时间，提高植株成活率，又可剥离较大的
6、茎尖，提高茎尖培养的成活率和脱毒率。 适用：大多数植物，并可除去一般培养难以去除的纺锤块茎类病毒,三、其他组织培养脱毒方法 （一）愈伤组织培养脱毒 将感染病毒的组织离体培养获得愈伤组织，再诱导愈伤组织分化成苗，从而获得无病害毒植株的方法，即愈伤组织培养脱毒法。 部分愈伤组织细胞不带病毒可能有以下两方面的原因： 一是愈伤组织细胞分裂增殖速度快，而病毒复制速度较慢，赶不上细胞的繁殖； 二是愈伤组织发生了抗病毒突变。,（二）珠心胚培养脱毒 柑橘类种子为多胚种子，除具有合子胚外还有珠心胚，种子一般不带病毒，因此珠心胚植株不易带病毒。 （三）微尖嫁接脱毒 指在人工培养基上培养实生砧木，嫁接无病毒茎尖（0
7、.14-1.0mm,带3-4个叶原基），以培养脱毒苗的技术。 脱毒程序：无菌砧木培养茎尖准备嫁接嫁接苗培养移植。,第二节 脱毒苗鉴定 一、直接检查法 直接观察待侧植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒引起的可见症状，从而可判断病毒是否存在。 二、指示植物法 将一些对病毒反映敏感，症状特征显著的植物作为指示植物，用以检验待测植物体内特定病毒的存在。即指示植物法。 特点：条件简单，操作方便，经济而有效，只能测出病毒的相对感染力。,一些常见病毒病引起的可见病症,指示植物法,几种马铃薯病毒的指示植物及表现症状,（一）草本植物鉴定 1、汁叶涂抹法 被鉴定植物取13克幼叶加10毫升水及少量磷酸缓冲液-研
8、碎过滤-加金钢砂作麾擦剂-汁液在叶面上涂抹23次接种 2、小叶嫁接法 指示植物作砧木，被鉴定植物小叶作接穗，常用劈接法。 （二）木本指示植物鉴定 1、直接在指示植物上嫁接待检植株的芽片 2、双重芽嫁接 3、双芽嫁接法,部分病毒的木本指示植物及相应症状,三、抗血清鉴定法 特异性高，测定速度快，几小时甚至几分钟就可以完成。植物病毒鉴定中最有用方法之一。 （一）原理 刺激抗体产生蛋白质抗原。抗原与抗体间能发生高度专一性的血清学反应（免疫反应） （二）方法 1、叶绿体凝集法 2、块茎沉淀法 3、环形接口法 4、酶联免疫法：用梅标记抗原或抗体的微量测定法。现在灵敏度较高和常使用的方法。,四、分子生物学鉴
9、定 1、双链RNA法 通过提取纯纯化待测植物RNA，并对其进行电泳分析，可确定dsRNA存在，从而判断待检植物是否带病毒。 2、互补DNA（c DNA）检测法 也叫DNA分子杂交法,五、电镜检测法 运用电子显微镜可直接检测待检植物体内有无病毒粒体存在，并根据所观察病毒的形态等对病毒种类进行鉴定。是较为先进的方法，但需一定的设备和技术。,第三节 无病毒苗的保存和繁殖 通过不同脱毒方法所获得的脱毒植株，经鉴定确系无特顶病毒者，既是无病毒原种。 无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好保存，这些原原种或原种材料保管得好可以保存利用510年。,一、
10、无病毒苗的保存 （一）隔离保存 通常无病毒苗应种植在隔虫网内，使用300目，即网眼为0.40.5mm大小的网纱，也可用盆栽钵。栽培用的土壤也应进行消毒，周围环境也要整洁，并及时喷施农药防治虫害，以保证植物材料在与病毒严密隔离的条件下栽培。另一种更便宜的方法，是把由茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖和保存。,（二）长期保存 1、低温保存 将无病毒苗原种的器官或幼小植株接种到培养基上，低温下离体保存，是长期保存无病毒苗及其他优良种质的方法。只需半年或一年更换培养基，也叫最小生长法。 2、冷冻保存（超低温保存） 用液氮（-196）保存植物材料的方法。常用冷冻保护剂为DMSO（5-8
11、%）、甘油、脯氨酸（10%）、各种可溶性糖、聚乙二醇等。（见十二章）,二、无病毒苗的繁殖 （一）无病毒苗的繁殖方法 1、嫁接繁殖 2、扦插繁殖 3、压条繁殖 4、匍匐茎繁殖 5、微型薯块繁殖,（二）无病毒苗繁育生产体系 我国农作物无病毒苗繁育生产体系归结为以下模式： 国家级（或省级）脱毒中心无病毒苗繁育基地无病毒苗栽培示范基地作物无病毒化生产,三、无病毒苗的利用 无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染。 生产场所应隔离病毒感染途径，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地方，要较长时间才会感染。而在种植时间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就可感染。 一旦感染，影响产量质量的，就应重新采用无病毒苗，以保证生产的质量。,思考： 1、说明植物茎尖培养脱毒技术原理及其影响因素 2、热处理脱毒原理是什么? 3、分别说明植物指示植物法和抗血清鉴定法原理 4、写出我国的脱毒苗繁育生产体系 5、查阅资料，了解我国脱毒马铃薯生产状况,