《酶免疫检验.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶免疫检验.ppt（62页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、免疫学检验,标 记 免 疫 技 术 广东药学院公共卫生学院 赵晓蓉,基本概念,一、免疫标记与标记免疫的概念 免疫标记技术： 标记物与免疫活性物质的联接技术 标记免疫技术： 以标记免疫物质检测相应靶物质的技术,标记的目的.?,二、常用的免疫标记物质,类别 标记物 用途 荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定 放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I 酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定 化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定 金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定,酶标仪,荧光显微镜
2、,FCM检测分析细胞表面受体的表达,液闪仪 计数器,金 免 疫 技 术,吸水纸,吸水纸,金标抗体,包被抗体,抗金标抗体,化学发光免疫分析技术,化学发光酶免疫测定：测定过程与传统ELISA相似，仅最后一步酶反应所 用底物为发光剂（鲁米诺-过氧化氢发光体系）,标记免疫技术的分类,一、按指示标记物质划分的类型 二、按测定方式划分的类型 三、按测定用途划分的类型,1、酶免疫技术 2、荧光免疫技术 3、放射免疫技术 4、化学发光免疫分析技术 5、金免疫技术,按指示标记物质划分的类型,1、均相型（homogenous） 2、非均相型（异相型 heterogeneous）,按测定方式划分的类型,均相型（ho
3、mogenous） 反应完成后，不用分离结合与游离的标记物,非均相型（异相型heterogeneous） 反应完成后，要分离结合与游离的标记物。 又可分为液相异相免疫测定和固相异相免疫测定,1、免疫测定技术 2、免疫组化技术,按测定用途划分的类型,第八章 酶免疫技术,本章要求,熟悉酶免疫技术的分类及原理； 掌握ELISA的方法类型及各方法的原理；测定方法的标准化； 熟悉酶免疫组织化学技术的原理；了解各类酶免疫组织化学技术； 熟悉免疫印迹法的原理。,酶免疫技术的基本原理 酶免疫技术是以酶标记抗原或酶 标记抗体为主要试剂，通过复合物中 的酶催化底物呈色而对被测物进行定 性或定量的标记免疫技术。,在
4、免疫组化染色时可指示待测反应物的存在和 定位，在酶免疫测定中，则可根据呈色物的有无和 呈色深浅作定性或定量观察。由于此技术是建立在 抗原抗体反应和酶的高效催化作用的基础上，故而 该技术具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好等 特点，而且，可与其他技术偶联而衍生出适用范围 更广的新方法。,酶免疫技术的分类,按检测对象的不同一般分为两类 1.酶免疫组织化学技术 用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原或抗体。 可指示待测反应物的存在和定位。 2.酶免疫测定技术 用于检测液体样本中可溶性抗原或抗体。 根据呈色物的有无和呈色深浅作定性或定量观察。,酶免疫技术的分类,根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的
5、酶标记物，可分为： 1. 均相法：不需要分离结合和游离的酶标记物，直接进行测定。 2. 异相法：需要分离结合和游离的酶标记物后才能进行测定。 固相酶免疫：ELISA 液相酶免疫,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),基本原理 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，且既保留其免疫活性又保留酶的活性。 标本中的抗原或抗体、标记抗原或抗体能按一定的次序与固相载体表面的抗体或抗原反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开。最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检
6、物质的量成一定的比例。 加入酶底物，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅对标本中的抗原或抗体定性或定量分析。,方法类型及基本原理,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 双抗体夹心法 双位点一步法 间接法 竞争法 捕获法 双抗原夹心法 中和法,一、双抗体夹心法,属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。 用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。 由于反应系统中固相抗体和
7、酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。,（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗
8、原夹心法测定标本中的抗体。,（二）双位点一步法,属于双抗体夹心法测定抗原； 应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体； 标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。 简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。但要注意防止钩状效应。,（三） 双抗原夹心法测抗体,用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。 形成“抗原-抗体-酶标记抗原”复合物,四、间接法,此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验。 基本原理:将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体
9、复合物，再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体，如羊抗人IgG抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。,特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合抗原及杂质； 加待测血清，血清中若有相应的抗体则与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤后，固相载体上仅剩下特异性抗体。其他免疫球蛋白及杂质不能与固相抗原结合被去除； 加酶标抗免疫球蛋白（酶标抗抗体）与固相复合物中的抗体相结合。洗涤后，固相载体上的酶量与待测血清中特异性抗体的量相关。若欲测人对某种病原微生物的抗体，可用酶标记羊抗人IgG抗体； 加入底物显色，颜色深
10、浅代表样本中待测抗体量。,五、竞争法,方法和特点: 酶标记抗原（抗体）与样品或标准品中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体（抗原）结合的能力； 测定管中加入待测样本与一定量酶标抗原（抗体）的混合溶液，使两者竞争性的与固相抗体（抗原）反应； 免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性）与样品或标准品中非标记抗原（抗体）的浓度成反比。 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。,六、捕获法测IgM抗体,先将针对IgM的第二抗体连接于固相载体，用以结合（“捕获”）样品中所有IgM（特异或非特异），洗涤除去IgG等无关物质，然后加入特异抗原与待检IgM结合；再加入抗原特异的酶标
11、抗体，最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶标抗体复合物，加酶底物作用显色后，即可对样品中待检IgM是否存在及其含量进行测定。,抗-链（或抗-IgM抗体）包被在固相上，形成固相抗-链（或抗-IgM抗体），洗涤； 加入稀释待测样本，样本中所有的IgM与抗-链结合，洗涤除去未结合物质；加入特异性抗原，它只与固相上特异性的IgM结合。洗涤； 加入针对特异性抗原的酶标抗体，使之与结合在固相上抗原结合，洗涤； 加底物显色，若有颜色显示，则表示待测样本中有特异性的IgM抗体存在。,七、中和法 常用于已知中和抗原检测样本中的未知抗体。 在固相上包被已知抗体，当检测样本中含有待测抗体时，与反应体系中加入的中和抗原
12、结合，反应过程不能形成“抗体-抗原-酶标记抗体”复合物，加入底物不显色，实验结果判为阳性；当检测样本中无待测抗体时，加入的中和抗原则与固相抗体结合，形成“抗体-抗原-酶标记抗体”免疫复合物，加入底物显色，实验结果判为阴性。,固相酶免疫测定的技术要点,ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液,试剂的准备,固相载体：最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯吸附蛋白质的能力较强，
13、抗体或蛋白质抗原吸附其上并保留原来的免疫活性。载体的性状主要有三种：小试管、小珠和微量ELISA板。 抗原和抗体：所用抗原要求纯度高，抗体效价高，结合力强。 酶和底物： ELISA中最常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶,酶和酶作用底物要求,活性高 有可结合的基团，不影响抗原抗体的免疫活性 反应产物易于判定或测量，方法简单,敏感,重复性好 酶活性不受样品中其他成分的影响,在均相酶免疫测定抗原抗体反应后酶活性可被抑制或激活 本身及产物无危害,性质稳定,价廉易得,常用酶及酶的底物,DH2 + H2O2 D + 2H2O 底物 受氢体 E 有色物质 辣根过氧化物酶 (HRP) 邻苯二胺(OPD) 灵
14、敏度高,比色方便，稳定性差,避光,致癌 四甲基联苯胺(TMB) 稳定性好,无致突变作用，水溶性差 碱性磷酸酯酶 (AP) 底物: 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 产物: 黄色的对硝基酚 -半乳糖苷酶 (-Gal) 底物: 4-甲基伞酮基-D-半乳糖苷(4MuG) 产物: 4-甲基伞形酮(荧光计测量),结合物 conjugate,定义:酶标记的抗体或抗原 在酶免疫技术中制备标记物的抗原应纯度高、抗原性完整；制备标记物的抗体应特异性好、效价高、亲和力强、比活性高、能批量生产和易于分离纯化。 制备酶标记物的方法应符合简单、产量高；避免酶、抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物；标记反应不影响酶的活性和抗
15、原抗体的免疫反应性等原则。标记物制备的方法基本属于两类： 1.直接法 2.交联法,交联法 交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为“桥”，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为： 酶-1-戊二醛-2-抗体（抗原） 1=2 同源双功能交联剂 戊二醛 1=2 异源双功能交联剂 羟琥珀亚胺酯 戊二醛易挥发，久置可发生聚合和氧化，降低交联作用。由于戊二醛单体的光吸收峰是280nm，而聚合体则在235nm，故新鲜的，保存得法的戊二醛其A235/A280nm的比值小于3。戊二醛应避光.低温保存。,直接法 直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分
16、子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记物，如过碘酸钠法。形成的结合物为：酶-抗体（抗原）。,测定方法的标准化,包被+封闭 加样 洗涤 孵育 终止反应 结果的判定,包被,将抗原或抗体固定在固相载体的过程称为包被(coating)。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。 这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。,包被用抗原： 天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片
17、段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。 包被用抗体 IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。 取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。 腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。,包被条件,pH9.6 碳酸盐缓冲液 pH7.2 的磷酸盐缓冲液 蛋白质用包被液稀释后加入酶标板（100或200l/孔），在4-8冰箱中放置过夜或3
18、7中保温2小时。 包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。 一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。,封闭,封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂： 0.05%-0.5%的BSA; 200l/孔 10%的小牛血清或1%明胶; 脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。,（二）加样 定量测定加样量应力求准确，加样时应将液体加在孔底，力求不产生气泡。样本和结合物的稀释应按规定配制。 一般100l/孔
19、（三）洗涤 洗涤是决定实验成败的关键。其目的是洗去没有与固相抗原或抗体结合的物质，以及非特异性吸附于固相载体的干扰物质。 Tween 20在ELISA中最为常用，洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。常用PBS- Tween 20。 洗涤步骤,孵育 (incubation),抗原抗体完成反应的保温过程称为孵育 加样品后、加结合物后都要孵育 孵育常采用的温度有43、37、室温和4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。 一般孵育30-60min，温度低，时间可延长。,终止反应,硫酸 柠檬酸 氢氧化钠 不同的底物有不同的终止剂,（五）结
20、果的判定,分光光度计检测结果可简单地用吸光度值（A）表示，并且根据每次试验所用的阴性和阳性样本确定标准。 一般以A/A02.1（A：样本吸光度值，A0：阴性对照吸光度值）表示，但阴性对照吸光度值必须大于0.05（最理想的是0.1），若低于0.05，则以阴性对照吸光度值加0.05为阳性判断标准，这种结果判定方式目前最常用。 用标准抗原或抗体做一系列稀释度检测，将测定的A值绘成标准曲线，可对样品中抗原或抗体定量。 用肉眼判断结果时，所用的底物必须显示较深的颜色。肉眼观察只能判断阳性和阴性（如+、+、+、+/、）。,酶免疫组织化学技术（EIHCT ）,是在一定条件下，应用酶标抗体(抗原)与组织或细胞
21、标本中的抗原(抗体)发生反应。如组织或细胞中含有相应抗原(抗体)，二者结合形成的抗原抗体复合物中所带酶分子遇到底物时，催化底物产生显色反应，在光镜和电镜下，就可识别出标本中抗原(抗体)的分布位置和性质；经图像分析也可达到定量的目的。 EIHCT主要用于标本中抗原(抗体)的定位和定性检测， 常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片等， 最常用的酶是HRP，供氢体是DAB。 与荧光免疫技术相比，EIHCT具有染色标本可长期保存。可用普通光镜和电镜观察结果。 EIHCT可分为酶标记抗体免疫组化技术、非标记抗体酶免疫组化技术和酶免疫电镜技术三种类型。,标记抗体免疫组织化学技术,1、直接法 用酶标抗体直
22、接与标本中的相应抗原反应，形成抗原-酶标抗体复合物，加底物显色，镜检。 其技术要点：标本用0.3%H2O2和80%甲醇液处理15 min，消除内源性过氧化物酶，石蜡切片需常规脱蜡，用胰酶37消化，PBS洗涤；用10%牛血清白蛋白封闭15 min，即制得抗原片；加酶标记抗体，湿盒37温育30 min或4过夜，PBS洗涤；加底物显色，光镜下观察结果。 该法具有操作简便、快速、特异性强、非特异显色低的优点，但一种酶标抗体只能检测一种特异性抗原，敏感性较低。 2、间接法 用已知抗体（Abl）与标本中相应抗原（Ag）反应，形成Ag-Abl复合物，加酶标记抗抗体（Ab2-E）反应，形成Ag-Abl-Ab2
23、-E复合物，加底物显色，镜检。 其技术要点：按直接法制备抗原片，加Abl（如鼠抗X），湿盒37温育30 min，PBS洗去未结合Abl；加酶标记抗抗体（如羊抗鼠Ig），湿盒37温育30 min，PBS洗涤；加底物显色，光镜下观察结果。 间接法用一种酶标记抗抗体与多种特异性抗体结合，可检测多种抗原，实用性与敏感性均较直接法好。,非标记抗体酶免疫组织化学技术,原理 酶标记抗体的方法，由于酶与抗体共价连接，抗体和酶的活性均受到一定的损害，若非特异性抗体同时被标记，将出现非特异性着色。 非标记抗体酶法，是先用酶免疫动物，制备高效价、特异性的抗酶抗体，将酶与抗酶抗体结合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab
24、2）作桥，与抗酶抗体和组织抗原上的抗体（Ab1）结合，通过酶底物的显色反应检测抗原。,技术类型,1、酶桥法 特异性抗体（Ab1）与组织标本的抗原反应后，用抗-Ab1抗体（Ab2，又称桥抗体）将抗酶抗体（Ab3）结合在Ab1上，利用抗酶抗体结合酶，最后形成Ag-Abl-Ab2-Ab3-HRP复合物，加底物显色。 该方法的Abl和Ab3必须是同种属动物的抗体，即Abl和Ab3分别是抗原和酶免疫兔产生的抗体，Ab2为羊抗兔IgG。 2、PAP法 即过氧化酶-抗过氧化物酶法 是酶桥法的改良法，基本原理与酶桥法相似，所不同的是用预先制备好的抗酶抗体与酶形成的可溶性复合物（PAP）代替酶桥法中的抗酶抗体和
25、酶。即PAP=Ab3-HRP 3、双桥PAP 是PAP法的改良法，通过两次连接桥抗体和PAP，形成Ag-Abl-Ab2-Ab3-HRP-Ab2-Ab3-HRP，即Ag-Abl-Ab2-PAP-Ab2-PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合的酶分子比PAP法更多，方法的敏感性更好，是当今免疫组化技术的中敏感性较高的方法。 4、APAAP法 是用AP代替HRP建立的碱性磷酸酶（AP）-抗碱性磷酸酶（AAP）法，简称APAAP法。引进生物素-亲和素建立的生物素-亲和素-碱性磷酸酶复合物法，方法的敏感性得到进一步提高。,酶标记免疫电镜技术,用酶标抗体与组织或细胞抗原发生特异性结合，加酶底物产生显色反应，在电镜下观察。该技术是将酶免疫技术的特异性与电镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上，对抗原物质进行定性分析的一种高度精确、灵敏的方法。 PAP法是首选的方法，标本的制备分为PAP的包埋前和PAP包埋后染色法两种。最常用的酶是HRP，底物常用DAB，DAB在HRP催化下形成吩嗪衍生物，经OsO4处理后变为锇黑，电子密度高，很适合电镜观察。而且HRP的分子量较小，易进入细胞内。,免疫印迹法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳酶免疫定位 （SDS-PAGE） 电转移 将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上 酶免疫定位,