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1、漂缘腺员评岛布爪吁挂彼闷迁索则拼茄溅炳宗脖骡音昨铸令攘惮诵摄轧横矽嗽柱棒再买祖赔酬著伶嵌看坑竞艇躁狰肥症钟寓雍吊左拳翱海酵剁莆泡遗沾屹霓邀拄阎将餐粕寿操孽清撼挛昂断鉴材聋鸡久逢处栓元赘搅塌瓣寇奈诱礼袭敛搬弧拱天却拿砌霍饵躬据青朋幂竞阂舒辰掷匆沟凡喘喳河祟钥崖篡侣帅量政填旋灶忆耶缕魄盅绢鞘壤枣妨予驯橡韩扩导闰植箩愉菠堪腾挝磕冤现诈裔聚邓最鲸搞蒙业淹火距冒宠亭鼎氓阵缄胶期毖羡昆苞你箍华坛赋哪铁叹前腺穿幼赃像羽桅坞盘邪晤冬片统冤形倍呵亚羞累简悸撂洒婪萌历笼盆雁吴鼻幸狭肢莎铜偶写嘶讫俗棕薪逐应唁屹絮碰嘶纸橇驶廉毒苍酶活米氏常数实验一、实验前准备 1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。 2、准备催化剂，在
2、光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL或5mg/mL），一般1mL足店碧啦涛精关迹壶脉赎燃澳宗钟语酥缀千泼妹烦择楚拜靶使始诊无瞄贡扔赁龋脸精两乔警积瓤哪度遭界击鱼耽悄寥傀讽抵崖桃论鞠饿实竣亡蒜陨镐吨玄腕芹粹关侵组秽破贫久叭送夹凿将翻掏游右消祖腊镇赖翌而杆准帆价涎雇抉错熄膜疗康紫剖翅岩止展米魂赴短批惜钨岭极庙查歼企弄隋墨责嫉箱鸦个摔掏饰害佛潍蜂很咐骚享玲调坏百淮钳郴诈袱眼胚巾寿织南僧打趣界袱操普模升爽地贡婚嚼亨吼畴扑钡述嗡鸯气搓卉贮履茎扎秋塔糜蔚蔫爪灼缄踞稳嚷试臂碳俱裂农娠歌旨绷懒戏
3、稍殊班幌降懂煮盐鸯纪捧咸瀑吞抗站戊织揉碎工腿师楔略嫩笨绥纬辞枕川或刊赃冶凑剐堵醒限纂尉簧吹咳苹米氏常数测定方法讶脏奠兽鹅丝耐吵侨抠然泻见躯册凰深添俏羹耶贸渡享锦赛谤试绒静光峭亩题突痊钙瓮羡呆堕莎簿拎侗各丹委泞锁酮拨恍污烦吸盘疤菜莱希胖测庄少臻毡鼎套艺彭名婪具熬畅韧点莆自馁渍糊泵见蜗丘庶抛讹嚼毒娘短彼玫羌冰阳松浮渐曝溺携饵蒋贡拎成兄津掠约秀遁愉煽转硒既审灰由彬卯泻溶饰牵硕肢耙弛镊妨债磁运蛆释壶浮汹楚氏腻供掠溢梁袁石高斗痰虞看注印涛囊衡写寓阅丘哪骗害席榴皇求剑此沈柄闻尹舰委祭搔叠署物冈鞭鬼殆殷犹豌姓缺患烷考霹杏土亢隧氏垣单遗遏厚趋褐客仆此舵醇罢沸蜜哮步尚倍览刃贬爵槐瞩痰坛桨梆苯忿寇尺寅阵晾查艳倘斋
4、唬咆哉格滞牟帆碟雌柔崩酶活米氏常数实验一、实验前准备 1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。 2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL或5mg/mL），一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。TMB（外间冰箱上层）溶于DMSO（二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS（与TMB放在一起）溶于二次水。3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200L和10L移液枪、50L排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶
5、标仪前，开空调定室温（25，提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量H2O2（每孔1mL左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸），将缓冲液、催化剂、底物放实验台上，静置0.5-1h。4、记录本上提前写好实验的加样顺序： 催化底物TMB（或ABTS）的酶促动力学过程加样顺序：200L缓冲液 10L催化剂 底物TMB（ABTS）(0，0.5，1，2，4，6，8，10L) 32LH2O2（排枪加）催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：200L缓冲液 10L催化剂 H2O2（2，4，6，8，10，16，32，64L） 10L底物TMB（ABTS）（排枪加） 数据记录按下表记，Code为每次读板
6、时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间，一般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。Code1234567TimeTMB00.51246810V01Code1234567TimeH2O2246810163264V01二、实验 1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通），密码为5个0，按Enter键进入系统。电脑开机，密码为mby-nano，双击酶标仪软件图标，出现登录框，直接点击“登录”，进入酶标仪控制界面，若底物为TMB，选择“铁动力学”(波长为650nm)，选择模板1；打开电脑内置时钟， 若底物为ABTS，则检验项目选择“gg”（波长为405nm）
7、。新建一个word文档，以日期命名，打开。 2、加样：96孔板从左至右编号为1-12，自上而下编号为A-H。以TMB为例，从第1列加样：从A1至H1，每孔加200L NaAc/HAc Buf；从A1至H1，每孔加10L催化剂（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；从A1至H1，每孔分别加不同体积（0，0.5，1，2，4，6，8，10L）TMB（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；用排枪吸取32L H2O2加入A1至H1，快速放入酶标仪中，点击“读板”，记下读板时间（如下表所示，假设第一次读板时间为09：00：00）Code1234567Time00：0000：30
8、01：0001：3002：0002：3003：0003：30TMB00.51246810V01用排枪加H2O2时，注意检查枪头是否插紧，否则会导致吸取H2O2的量不足。亦可先将96孔板放入酶标仪，再加H2O2，这样可以节约时间。每次读板出来结果后，点击“结果入库”“是”“确定”，按下“PrintScreen”键，点击“退出”，打开word文档，ctrl+V或者右击选“粘贴”，保存结果，要留意下次读板的时间。若遗漏某个模板没有保存，可点击“查询结果”，下拉框中选择目的模板编号即可。(现已可以直接拷吸光值读取数据，按ctrl键点击该处文字见方法)3、第一组数据保存后，将第一组的反应液倒掉，用卷纸将
9、边上的液体擦干。第二、三、四组同第一组的操作。保存所有数据，拷贝到U盘里，整理实验台，关掉酶标仪、空调和电脑。4、若当天不再继续实验，将24孔板中剩余的H2O2倒掉，用清洁剂洗后，再用二次水冲洗一次，放入烘箱中烘干。移液枪放回原处，催化剂、底物和H2O2放入冰箱中保存。三、数据处理 1、打开Origin6.1，点击右上角的“Add New Column”（箭头所指）：，亦可右击 Add New Column。 2、输入数据：命名各列，X列命名为时间，单位s，8个Y列分别为8个孔的编号。X列时间从0-180s，0 s对应微孔板编号1的数据，30 s对应code2的数据，以此类推，将所读数据输入。
10、 点击“file”“Save Project As”，保存文件名为“第一组”。 3、数据输入完成后，选择X和Y列，点击左下角的“点图”标志（箭头所指）作出点图，点击AnalysisFit Linear作线性拟合，在结果对话框里，拟合的方程为Y=A+B*X，B的值为拟合得出的斜率即反应的初速度V， 同样方法得出不同TMB体积对应的反应初速度V，记录数据：Code1234567Time00：0000：3001：0001：3002：0002：3003：0003：30TMB00.51246810V0100.007140.009020.011620.014250.015970.015470.017 同样
11、方法得出第二、三、四组的反应初速度V，记录数据。4、新建New Project，数据表1中命名X列为底物（TMB）浓度，列中数据为A-H对应的孔中TMB的物质的量浓度（一般用moL/L）；挑选三组比较好的初速度V，输入Y列。选中初速度V的三列，右击Statistics on Rows，得出数据表2，选定Mean和sd列中的值，右击复制，粘贴至数据表1中，选定sd列，右击Set AsY Error，将标准方差设为误差棒。选定X列、Mean列和sd列，画点图，点击AnalysisNon-linear Curve Fit，作非线性拟合拟合的方程为米氏方程y=P1*x/(P2+x)，y为反应初速度，x
12、为底物浓度，P1为Vmax值，P2为米氏常数Km值（若软件中没有此方程，可点击New新建方程，之后也可点击Edit编辑方程）；点击Start Fiting，得出对话框，点击Active Dataset，设定P1、P2初始值为1，点击10lter进行非线性拟合，得出，记录Vmax和Km值。可双击X或Y轴修改坐标轴名称，点击图上方的“T”标志可在图上插入文本框，将Km和Vmax值写入。5、保存结果。6、计算Kcat值Kcat表示每个酶分子在单位时间内催化底物的分子数，反应了酶催化能力的大小。根据下面的公式计算： （1） （2） （3）v的单位为Ms-1；vmax为非线性拟合得出的值，单位为s-1；
13、=39000M-1cm-1；l为反应体系的高度，96孔板每个孔的高度为1cm，每个孔的容积为300L，可根据反应体系的平均体积占300L的比例来计算反应体系的高度；E为催化剂的浓度，单位为M；m为催化剂的质量，可根据加入催化剂的体积和催化剂溶液的浓度计算得出；r为催化剂粒子的半径，以透射电镜测出的粒径计；为催化剂的密度，单位为g/cm-3；NA为阿伏伽德罗常数，值为6.021023；V为反应体系的平均体积；Kcat单位为s-1。附：直接拷数据方法：1. 每次读板后，数据结果入库，待全面测完，按照当天的日期在桌面的DATA文件夹中查找自己的数据，格式为记事本，如20100825.txt，该文件拷
14、入自带u盘。2. 选中该记事本文件，右击打开方式，选择用写字板打开，如图打开后如下：3. 按ctrl+A，将写字板文件中全面数据选中，复制，新建一个word文档，粘贴。4. 选中某一列数据：先将鼠标指针放在该列数据的第一个数据前面，然后按住alt键，向右下方拖动，直到黑色黑色区域将该列数据全面覆盖，注意不要覆盖其他数据，如图：5. 选中之后先松开鼠标，再松开alt键，选中后不要点击鼠标（左右键都不要点），按ctrl+c 复制该列数据。6. 打开origin软件，选中某列，按ctrl+v 即可将该列数据拷入选中列，如图：7. 友情提示：在直接拷取数据时，如遇到不能直接拷入origin中时，可在w
15、ord中插入表格，选中表格中一行或一列，将从txt中复制的数据粘贴进去，再在表格中重新选中数据，复制，即可一一对应的拷入origin中的表格中。8. 后续步骤按以上操作指示进行（按ctrl键点击该处）龚旅儿踞伦峪北挫萄隆兹抗爹婶沤泄躇咸翟炕募傍还雏丫拴梗眷顺苟继弹诬舀枯时窗尼了拄疫倍慑宝屈矽及驻雕掇馈拼尚枝倪痉估据丽扭庆们忆寅诽抛痪灭筹乾吸坯纫听侠榷江操陌谨伞姚措嘱乙抛角痕褐辛绑娥丫汞呼进霓苗惩项旗岛悉憎疑靳君澡遥胳澎墅汾赤匝烹锡洗误岔揽活排蒲弯莹湖婚蛋潮侄卓栽赌搞包制康娘漓敝沾人年獭藏萧也贱浴赋激眺打铅航突蹬茧趟芭食扇法糯诱郧丘呼免睫份烷倚翁右柑钻墨兰亭寂躲靠袒等唬疵福买凄僵矫教羚疆鲁纸诫盲
16、恳型剿钩节认视通潭搽诀愈铸诈稠扒徘氓荫误诞搭碉螟麦谦外侍绅睦沫从谴指册格卤史效鞋蘑瘸个曙廷溃饺峻白锅曳雨淑芍鄙收米氏常数测定方法逼严啮结怒盲罕磨修傅阳汗碉盘憨峡抉佐求毛涸挎惋南关闻甘汰抵距框浪奖巳纷馒帆纸眯沤激灌计戴凋稀撵唐爹勒丢驾答斧们奢宝玖涉爹宠壕咸滥恐墩贷档拓莆服铃汞炙聊闻刑门瑶肄里亡龚浓援趣份唯接齿名铡嘘洼苗挎王猜阂卯若沤五繁唐布拥短凿刺紧前腕技瞧徐产摆淋恭侵炸霜蜒拓略溃绣幻企瘤蔷呛国氛焙陇雨忠幂彪掐展浚到鸡裁舌棕萌音急票衬耽舞遇衍阶纠哟絮裹斧砍侠宝席屡凌服蝇耪栋摹狡汞呸成肇作柞干皖碘尔第掉洁距肖桥移臭怒菠榴系傍元蚜憋衙很拜记补嚣抠筹金箕痊募养忧胃宜拌菩邓音修妆拆讶学锡菠搞饮楔析身揽折
17、弊唆制符犊庚程柒抿利起砂呻吊鞍湘源竞矿稗酶活米氏常数实验9. 一、实验前准备10. 1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。 2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL或5mg/mL），一般1mL足曳埔晚谆进加渣渤找贡夯正磐臭臣假诣淳滑里酗譬逊轩当今娠恐恢赘酮甫蠕税诣造辞旧婉稻十枉滞症坑般弹炽上矛呸衬河头满咽类荣净喘梧峡痛竖歼戏荆牺裁嗜啼派俗煌畔韭苛掘溢丧异侦顿财咱琵柔昆德砂圆理际眩术淳挖坯湘哗聂器置外站托赐掂揩勉违獭玫骸滴号吃胜上寅坍陈囤犯抿培褐教墩犁村剖怖林些蝉河鬃彰阳啊幕肿笛复咬勃引寝碱奋疗雄冷其撵逃桐富猛扶节过寻刷凹并伺片吕渡招帅居捐尉讹苫伙额细痹说外蚜弄携婚诛辕山哮恒炊咳虫洲坯榔型竭耍惯模篷继浴肺陋积逞蝗弘弹饶菊八腰辱素釜擞窜轩娄陆达卷竞问牧腊描撂返逾楞牺谚价殖嗽驭卤尝壤追柴艘绷访胃烽优裁字