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1、柑橘溃疡病菌中以分裂隔膜为目标作为GFP标记的蛋白质的亚细胞定位读书报告 专业 ：应用微生物 学号 :112011325001861 姓名 :左佩佩目录摘要- 2 -引言- 2 -材料和方法- 4 -细菌菌株和培养基- 4 -一般方法- 4 -病原性实验- 6 -荧光显微法- 7 -结果- 7 -Xac中蛋白质表达载体的构建- 7 -表达系统显示稳定的整合到Xac染色体上- 8 -破坏amy基因座不改变Xac的毒力- 9 -Xac中蛋白质的亚细胞定位- 12 -讨论- 16 -柑橘溃疡病菌中以分裂隔膜为目标作为GFP标记的蛋白质的亚细胞定位摘要柑橘溃疡病菌（Xac）是产生柑橘癌症的原因，是影响
2、全世界柑橘的一种重要的疾病。为了了解Xac的重要生物学过程的特点，我们构建了在这种细菌中用绿色荧光蛋白（GFP）标记的蛋白质异位表达的整合质粒。我们指出-淀粉酶基因（amy）的破坏-质粒整合到细菌染色体上的位点，没有改变细菌的病原性，然而完全破坏了Xac降解淀粉的能力。进一步说，GFP表达系统被用来描述ORF XAC3408的特点，通过Xac编码的假设蛋白质，这个蛋白质与枯草芽孢杆菌中的FtsZ稳定因子ZapA具有明显的同源现象（ZapABsu）。Xac中表达的GFP- XAC3408显示了GFP-ZapABsu一个典型的隔膜定位类型，这个表明XAC3408是细胞分裂蛋白ZapABsu的Xac
3、直系同源基因。这个结果显示Xac中用GFP标记具有功能特点蛋白质的潜力，另外，在隔膜处标记的Xac突变株构成一个生物模型，为了检测抗菌化合物抑制植物病原体细胞分裂。关键词 ：柑橘癌症；细胞分裂；-淀粉酶引言柑橘溃疡病菌是革兰氏阴性菌，是影响大部分柑橘属的植物病原菌，并且是成为植物癌症的原因，对全世界来说是柑橘属植物的一种非常重要的疾病。不存在有效控制这种病的方法，更加详细了解生物病原性机理可能在实质上形成预防和控制感染的方法。完成这个任务的主要工作是阐明Xac的基因组序列，基因组序列已经促进利用Xac作为模式微生物进行大量的分子研究，然而，没有合适的技术方法可以促进蛋白质组检测。我们主要集中研
4、究Xac的某些重要生物学过程的特点，在染色体分离和细胞分裂中包括的更加特殊的生物学过程。这个细菌系统的一个共同的特点是这个细菌系统经常有蛋白质构成的，这些蛋白质与在许多衍生的真核生物中与他们功能相似的蛋白质具有很少的同源性；因此，这些蛋白质构成抗菌药物形成和病原控制构成完美的目标。然而，为了在Xac中着手进行蛋白质功能研究，我们为这个目的缺少发展的和/或者可利用的生物学功能。我们描述了Xac中一个蛋白质表达系统，这个也能够被用于这个病原体中用绿色荧光蛋白（GFP）标记因子的亚细胞定位。我们利用这个系统来描述Xac中假设蛋白质的特点，这个蛋白质与FtsZ稳定因子ZapA具有明显的同源性，FtsZ
5、稳定因子ZapA最初在枯草芽孢杆菌中被描述（ZapABsu）。此外，我们指出-淀粉酶基因的破坏，质粒整合到染色体上的位点，没有改变细菌的发病机理。材料和方法细菌菌株和培养基利用的是以被测序的柑橘溃疡病菌菌株，以前特指的柑橘溃疡病菌菌株306（IBSBF 1594）。大肠杆菌菌株DH10B被用于克隆。大肠杆菌利用LB/LB琼脂培养基在37条件下培养；Xac利用营养琼脂酵母甘油（NYG）/NYG琼脂培养基在30条件下培养。分别加入20和10l mL-1的氨苄青霉素和卡那霉素。对于-淀粉酶检验，在NYG琼脂培养基中加入0.2%的可溶性淀粉；在细菌生长以后，把培养基曝光在碘晶体形成的水蒸气中，在培养基
6、上形成环。一般方法利用Amaral等描述的方法进行Xac的电转化。寡核苷酸在支持信息，表S1中被列出。通过几个DNA盒的有序连接构建整合的GFP表达载体（图1）。首先，通过两个合成的寡核苷酸经退火形成一个含有57bp的双链（ds）DNA，两个合成的寡核苷酸：核糖体结合位点（RBS）（顶部和底部）。这个dsDNA含有RBS，并且含有Hind兼容的末端。这个双链DNA被连接到pUC18/HindIII (NEB)，形成pTAS1。用EcoRI/HindIII对pTAS1进行酶切，与木糖启动子和它的抑制DNA (xylR-pxyl)相连接，形成pTAS3，这两个基因都是从pEA18中分离的，也用Ec
7、oRI/HindIII进行酶切。产生的pTAS3，用BamHI/XbaI进行酶切，与gfp基因连接，（位于BamHI/XbaI的侧面），因此，形成pPM1（来自pEA18的gfp利用引物GFP_WO_STOP/GFP_F_C-ter 进行PCR扩增）。因为Xac本身对氨苄青霉素有抵抗力，pPM1的标志，表达盒(xylR-pxyl-gfp)被移动到pCR2.1-TOPO，这个表达盒对卡那霉素具有抵抗力。利用的方法是PCR连接，利用引物pUC18和pCR2.1-TOPO与他们的多聚接头侧面具有相同的DNA片段这个事实。利用Pfu DNA聚合酶（试剂盒）以及引物M13F-TOPO和M13R-TOPO
8、从pPM1中去除表达盒；利用引物M13F-TOPO和M13R-TOPO获得pCR2.1-TOPO的主干，设计的两个引物为了使外侧的多聚接头退火，但是指向卡那霉素基因。两个扩增产物等摩尔混合，并且与最终的PCR连接，不需要引物，形成pPM2。最后，相当于Xac amy基因（XAC0798）的106-902bp的DNA片段，利用引物XamyFOR5/REV5进行PCR扩增，并且用pPM2/EcoRI进行连接，形成pPM2a。用GFP_BHI_XhoI/GFP_NheI通过gfp再扩增把多余的限制性位点加到pPM2a。利用BamHI/XmaI对PCR产物进行酶切，并插入到pPM2a BamHI/Xm
9、aI位点之间，形成pPM7g (GU988753)。随后，来自pPM7g的gfp基因被mCherry盒代替，用于以后的蛋白质共同定位实验。所有的质粒DNA测序通过PCR检测。利用引物3408F/3408R分离ORF XAC3408，用XbaI进行酶切，并且连接到pPM2a/XbaI。按照Sambrook等的描述进行蛋白质印记技术。在兔子体内抗GFP主要的抗体是多克隆抗体。随后，按照Amersham ECLWestern Blotting System kit (GE)进行抗体的检测和化学发光反应。图1 Xac的GFP表达载体。pPM2a和pPM7g，与位于gfp侧面的限制酶切位点不同，这两个载
10、体利用pCR2.1-TOPO主干被构建，并且含有像pUC一样的复制起点（ori），以及具有抗氨苄霉素（Ap）和卡那霉素（Kan）的DNA盒。两个载体上的蛋白质表达系统由木糖启动子（pxyl），木糖抑制物基因（xylR），和gfp基因；启动子和gfp盒被一个短的DNA片段分开，这个片段包含一个RBS。DNA插入的唯一的限制性酶被绘制在图的右手边，还有ATG和系统的终止密码子。染色体整合前导序列，amy106912，是一个从Xac（ORF XAC0798）的-淀粉酶基因中提取的800bp的片段。病原性实验用于实验的植物宿主是巴伊亚的甜橙和伦哥布尔的酸橙。柑橘树生长在25-35微室内。细胞在合适的培
11、养基中培养，直到OD600 nm0.6 (108 CFUmL-1)。随着生长，在皮下注射器（1ml）的帮助下，把细胞悬浮液接种到远轴表面的树叶。在培养3周的过程中观察症状。荧光显微法细胞在合适的培养基上培养，直到OD600 nm0.3。取20l的细胞培养物滴到显微镜载玻片上，加入一薄层的1磷酸缓冲液中的1%琼脂糖，然后盖上盖玻片。利用Olympus BX-60显微镜进行细胞观察，显微镜上装有DP71冷冻照相机。利用IMAGEPRO-MC（版本6.0）捕捉和处理相片。结果Xac中蛋白质表达载体的构建在我们了解Xac中控制的蛋白表达之前，为了这个细菌我们形成了蛋白质表达系统。构建的表达载体（pPM
12、2a和pPM7g）是整合的，含有木糖启动子(pxyl)，木糖阻遏因子(xylR)，和gfp编码序列（图1）。木糖启动子对蛋白质表达水平的有规律的控制是众所周知的，在枯草芽孢杆菌中已经被广泛应用。木糖启动子和gfp基因被一个短的dsDNA所分开，这个短的合成的dsDNA包含RBS，以枯草芽孢杆菌和大肠杆菌一致为基础。唯一的限制酶切位点存在于gfp基因的两个末端，允许与基因与随后的N-或C-末端GFP蛋白质产物融合产物相连接。两个载体有一个pCR2.1-TOPO主干，以至于它们含有一个卡那霉素盒，一个可选择的Xac标记，以及一个像pUC一样的复制起点。因此，这些载体在Xac中不复制，可以被用于直接
13、的位点突变，研究基因功能的一个关键方法。最后，pPM2a/pPM7g含有Xac (amy106912)的-淀粉酶基因的片段，影响它们整合到染色体上的发生。表达系统显示稳定的整合到Xac染色体上pPM2a/pPM7g整合到染色体是表达盒放到细菌中一个重要的条件。整合至少发生在一个单一同源重组事件，或者具有特征的ORF和自身染色体复制或者存在于载体的amy106912片段和染色体amy基因作为瞄准的目标。amy106912和染色体amy基因座的重组应该产生在琼脂培养基上不能够降解淀粉的Xac突变体。为了检测这个整合，通过电转化把pPM2a插入到Xac中，并且在含有卡那霉素的NYG琼脂平板上寻找突变
14、菌株。挑选出抗卡那霉素的Xac突变体，随后接种到含有淀粉的NYG琼脂培养基，以至于它们能够降解这种物质的能力能够被监测（图2.a）。除了野生菌株（白色箭状物）以外，全部的突变菌落在淀粉降解上是有缺陷的，表明pPM2a能够被整合到Xac的amy基因座。为了建立质粒整合位点，我们进行了一个诊断的DNA印记实验。来自两个独立地kanR突变体的全部的DNA用EcoRV进行酶切，并且用标记的amy基因探针探查（图2.b和c）。野生菌株产生一个6051bp的单一的信号（图2，b和条带1），这个相当于包含amy基因的EcoRV片段（图2，c，相对的基因组946596952647）。相反地，两个突变体显示了两
15、个信号：2249和9686bp（图2，b，泳道2和3，条带2和3），pPM2a整合到细菌amy基因座的期待的结果（图2，c）。同时，数据显示表达载体在染色体上有重组的amy基因。破坏amy基因座不改变Xac的毒力在强调我们的蛋白质表达系统的功能性之前，检测Xac amy:pPM2a突变体是否能够在植株上产生病症，是非常重要的，评估-淀粉酶在细菌的集群现象和/或致病性/毒性因子方面是否能够发挥作用。把Xac amy:pPM2a突变体接种到甜橙和酸甜橙的树叶上（Xac的自然宿主），接种在野生菌株的旁边。从接种之日起，在3周内，我们观察症状的表现，从接种之日起，在第20天照相（图3显示了一个代表实验
16、）。在我们的实验检测到野生型表型没有改变，在树叶上产生的枯斑表明接种的全部突变体像野生菌株一样有能力。另外，我们检测到形成的疾病类型没有改变，在同一时标都检测到损伤。我们也检测了突变菌株的生存能力，通过分析它们在液体培养基上生长和依靠琼脂平板的菌落的相对的倍增时间，再次，没有观察到变化（数据没有指出）。总之，这些结果表明Xac amy:pPM2a突变体产生疾病的能力没有影响，并且增加了GFP表达载体的价值，载体具有包含毒力和致病性可疑的ORFs的特点。 图2 表达载体pPM2a和Xac的染色体的整合产生amy基因的破坏。（a）通过卡那霉素抗性候选基因在包含可溶性淀粉（0.2%）的NYG琼脂培养
17、基检测整合的amy基因座。Xac突变株缺少-淀粉酶在群落中不能够降解淀粉，不能够形成像野生菌株（白色箭头）那样的环。通过把培养基暴露在碘蒸气中观察环的现象。四个选择的突变株的（b，c）Southern blot的分析不能够降解淀粉。全部的DNA被EcoRV (ERV)进行酶切，利用amy基因作为探针被杂交（b）。泳道1：Xac野生菌株；2和3，两个独立产生的Xac突变株，含有pPM2a整合到amy基因座；4和5，两个Xac突变株含有pPM2a-XAC3408（见下面的部分）。在X射线图像上标记的条带1,2，和3，相当于利用Xac 306基因组候选基因(c)估计DNA片段：1,6051bp的ER
18、V片段，包含amy基因(946 596 . . . 952 647)；2和3 2249和9686bp的片段（突变株泳道4和5，增加的300bp相当于ORF XAC3408），分别被含有pPM2a的突变菌株产生。片段1中amy基因（XAC0798）的位置被一个黑色箭头所代替（基因组候选基因c947 237 . . . 948 664）；片段amy106-912（见图1）的相对位置也被指出。Xac中蛋白质的亚细胞定位通过蛋白质印记法对GFP表达载体的功能进行分析。含有一个整合到amy基因座的表达盒的单一复制品的Xac amy:pPM2a突变体菌株，在NYG培养基中进行培养，在野生菌株（阴性对照）旁
19、边，并且用木糖处理，通过突变体来诱导GFP产物。准备好的全部的蛋白质，利用十二烷基硫酸钠凝胶电泳分离，并且被转移到聚乙二烯氯化物膜上，为了检测GFP的产物，利用多克隆抗体与突变菌株杂交。GFP（27 kDa）大小的条带在Xac amy:pPM2a突变体中清楚的被检测到（图4，泳道2），然而在野生菌株中没有看到相同大小的条带（泳道1）。条带比GFP mark要高表示它们之间没有相互作用，可能因为血清中多克隆抗体的特点。GFP检测确认表达质粒的功能性。图4 通过突变菌株利用蛋白质印记法检测GFP产物和GFP-XAC3408。通过Xac amy:pPM2a和Xac amy:pPM2a-XAC3408
20、利用GFP和GFP-XAC3408蛋白质的表达证实pPM2a的功能性。泳道：1，Xac WT；2，Xac amy:pPM2a；和3，Xac amy:pPM2a-XAC3408。通过在含有0.5%木糖生长的突变菌株诱导蛋白质表达，蛋白质表达被增加到OD600 nm0.5，在蛋白质提取准备物之前2h。表达的蛋白质的相对位置被用黑色箭头标出。在蛋白质定位实验中利用GFP和Xac融合的XAC3408的ORF的表达产物对我们的表达系统进行检测。XAC3408编码的假设蛋白质作为细胞分裂因子ZapA的Xac中的候选蛋白质，首先在枯草芽孢杆菌中具有这个特点。如果XAC3408的产物真的是ZapABsu的直系
21、同源产物，那么GFP- XAC3408将会像期待的一样定位到分裂隔膜，因为ZapABsu与Z环相联系。XAC3408被克隆到pPM2a中，完成了Xac转化，随后在含有淀粉的NYG琼脂营养培养基中挑选Xac amy:pPM2a-XAC3408突变体，基于它们没有能力降解淀粉。然后，利用Southern blot来估测两个突变体，确认质粒和amy基因座的特殊整合（图2，b）。表明两个Xac amy:pPM2a-XAC3408候选突变体显示了与Xac amy:pPM2a突变体相同的条带图像（比较泳道2-3和4-5）；唯一的不同是较大片段的大小（条带3），他有多余的300bp，相当于ORF XAC34
22、08。这些结果表明在Xac突变体中，pPM2a-XAC3408和amy破坏的整合。在显微镜观察之前，利用蛋白质印记法证实是否GFP- XAC3408能在Xac中表达（图4）。检测到一个大约38 kDa的条带（泳道3），他的大小与融合的GFP- XAC3408的大小一致，只在检测的Xac amy:pPM2a-XAC3408突变菌株中产生。然后，我们在荧光显微镜下观察了Xac amy:pPM2a-XAC3408突变体细胞，结果，大部分的细胞显示了在杆中间像棒状一样的结构，定向垂直于它的纵向体轴（图5），GFP-ZapABsu的一个定位类型特点。为了确定看到的定位不是假象，在进行显微镜检验之前，我们
23、用蛋白质合成抑制物氯霉素处理Xac amy:pPM2a-XAC3408突变体细胞。在抗菌素处理之后，隔膜棒消失，表明观察到的类型是真的GFP- XAC3408的定位。图5 GFP- XAC3408的亚细胞定位。Xac amy:pPM2a-XAC3408突变菌株被培养在30下NYG培养基中，知道OD600 nm0.3。GFP- XAC3408在固定的活细胞中在覆盖有一层1%琼脂糖的显微镜载玻片上被检测。GFP- XAC3408定位用白色箭头指出（1000的扩大倍数）。最后我们检测了Xac amy:pPM2a-XAC3408突变体诱导植物疾病的能力，以及检测到毒力下降（图3）。在突变体中不能够形成
24、在野生菌株观察到的那种典型的褐色/喷火状的损害，因此可能是由于突变体表达了多余的XAC3408（GFP- XAC3408的形式）复制物的原因，可能扰乱了正常的细胞分裂和发病机理。图3 Xac中amy基因的破坏没有改变它的病原性或者毒性。Xac的突变菌株含有表达载体pPM2a（Xac amy:pPM2a）或者GFP- XAC3408（Xac amy:pPM2a-XAC3408）被接种到甜橙和酸甜橙的树叶上，在3周过程中检测致病症状的形成。突变株相对于阳性野生菌株(WT)的位置被标记在画面上被放大。上面，显示了一个具有代表性的实验。进行三个重复实验。讨论距离Xac基因组序列公布已经有5年时间了，显
25、然地，大规模的蛋白质组分析限制在一些报道中，利用的技术例如二维蛋白质凝胶电泳，酵母双杂交，以及折叠蛋白质的和磁共振扫描。此外，有机物中由于异源蛋白质表达的最近的两个方法与我们用到的方法不同。探索Xac的生理最大的限制在于完全缺少适应这种细菌的蛋白质表达系统。因此，Xac中我们指出构建和检测新的Xac蛋白质表达载体，随后利用我们的系统描述假设的蛋白质XAC3408的特点。XAC3408与枯草芽孢杆菌细胞分裂蛋白ZapABsu有30%是相同的（在氨基酸水平上），利用GFP- XAC3408的亚细胞定位实验支持XAC3408是Xac中ZapABsu的直系同源蛋白质这个假说。像ZapA一样的蛋白质在细
26、菌间是保守的，它们具有促进FtsZ捆绑和FtsZ聚合物稳定的作用。ZapAXac显示与在ZapABsu中相似的定位类型，在隔膜标记的Xac突变体的可用性提供了一个新的观点，Xac抗菌药物实验，目的是干扰细胞分裂。这里所描述的载体是整合的，并且允许来自Xac的amy基因座的蛋白质异位表达。这个方法已经被广泛的应用于革兰氏阳性杆菌枯草芽孢杆菌中，认为是避免基因/染色体区域产生干扰，在细胞生长和改变表型中可能产生不想要的效果。另外，整合到amy具有接受必要的基因特点的优势，可能在基因编码序列中不适应改变。最后，amy的破坏在平板上产生容易检测的细菌表型，并且允许插入区别，这些插入区别发生在那些被检测
27、基因的amy中。在目前的工作，我们指出-淀粉酶基因对Xac在平板上生长不是必须的，在感染期间也没有发挥任何关键性的作用，有些期待的结果，因为结果已经被指出细菌-淀粉酶可能对含有淀粉培养基上的细菌的生长是必须的，但是在含有其他碳源的培养基上生长不是必要的。然而，最近的报道已经指出Xac的发病机理需要amy基因座。在他们的分析中，3300Xac转座子插入突变体的收集，利用他们在植物中的致病能力筛选突变株，断裂的ORFs中，XAC0798 (amy)被发现是导致细菌某些改变的原因。相反，在我们的试验中，通过pPM2a插入而被破坏的XAC0798的发病机理和毒力没有产生任何的改变，即使使用相同的植物，Laia等使用过的伦哥布尔酸橙。这个差异可以通过实验来解释，通过挑选假设的Xac amy:转座子突变菌株，这个突变菌株含有一个对发病机理来说必要的区域的额外的突变（可能是自发的），通过Laia等的方法进行筛选。Xac含有1600假设的ORFs，这些ORFs中相当一部分对宿主植物具有致病性和毒力。因此，这里描述的GFP表达载体不仅组成特殊蛋白质研究的额外的工具，而且是蛋白质功能研究的一个辅助方法，与在枯草芽孢杆菌和柄杆菌属中已经研究的相类似。- 18 -