水稻温敏不育相关基因RNAi和过表达载体的构建及遗传转化.pdf

《水稻温敏不育相关基因RNAi和过表达载体的构建及遗传转化.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《水稻温敏不育相关基因RNAi和过表达载体的构建及遗传转化.pdf（76页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、海南大学 硕士学位论文 水稻温敏不育相关基因RNAi和过表达载体的构建及遗传转化 姓名：麦景强 申请学位级别：硕士 专业：作物遗传育种 指导教师：陈守才 20080501 摘要 本实验室于2 0 0 2 年用具有明显育性转换特征的水稻温敏核雄性不育系T b 7 S 为 材料，通过抑制性削减杂交( S u p p r e s s i o nS u b 仃犹d v cH y 嘶d 幻蜥o n ，S S H ) 技术筛选减 数分裂期的T b 7 S 幼穗在高温可育和低温不育条件下的差异表达c D I N A 片段。经S S H 富集c D N A 片段构建了两个c D N A 质粒文库，即T b 7

2、 S 可育幼穗和不育幼穗的c D N A 消减文库。并从可育幼穗c D N A 消减文库随机挑取3 9 克隆进行测序，但没有进行 I k v c 璐e r t h e mD o t b 1 0 t 鉴定。 本研究选取上述3 9 个克隆中的3 7 个克隆进行R e 邶e mD o t - b 1 0 t 鉴定， 剔除假阳性后，共获得1 1 个差异较明显的阳性克隆。 根据R - e V e r S eN o r 出锄D o t - b l o t 鉴定的结果，选取差异表达最明显的基因作为转 化水稻的目的基因。将选取基因的序列在水稻全长c D N A 数据库进行比对，选取与其 他水稻基因连续相同的碱

3、基数不超过2 1 个的一段序列作为R N 灿干涉片段，并根据 这段序列设计R N A i 引物，克隆这些基因和删片段。测序表明，已经成功克隆到 R N 础片段鼬O s 2 4 3 、融O s l 8 3 、础O s 3 7 l 、砒O s 4 0 8 和基因O s 3 4 8 、O s 3 7 1 、O s l 8 3 。 选用p T C K 3 0 3 作为实施对、i A 干涉和过表达策略的植物表达载体，将R N 触片段 进行两次酶切连接，分两次连接到载体中，第一次正向连入，第二次反向连入，构建 成R N A j 植物表达载体p T C K 3 0 3 黜0 s 2 4 3 、p T C K

4、 3 0 3 鼬0 s 1 8 3 、p T C K 3 0 3 融O s 3 7 l 、 p T C 飚0 3 慰O s 4 0 8 。将基因O s 3 4 8 、O s 3 7 1 、O s l 8 3 进行一次酶切连接，连入过表达 载体中，构建成过表达载体p T C K 3 0 3 O s 3 4 8 、p T C K 3 0 3 O s 3 7 1 、p T C K 3 0 3 O s l8 3 。 构建完成的R N 加和过表达载体通过农杆菌介导方法转化水稻，经共培养、选择 培养、分化培养后得到6 株p T C 硒0 3 O s 3 7 1 载体转化的T o 代植株。提取转化植株的 肼

5、、A ，进行P C R 检测，4 株扩增出目的条带，结果证明基因O s 3 7 l 已经整合到水稻 基因组中。 关键词：水稻温敏核雄性不育R N 础过表达遗传转化 A b s t r a c t T w 0S u b 嗽伽c D N Al i b 谢e sh a db e e ne s 协b l i s h e db ym yl a b o 僦呵吣啦t k T W o d 眈c t i o 砌( f 0 1 w a r d 锄db a c k w a 叫) S u p p r e s s i o nS u b 仃a C t i v eH y b 嘣i 2 斌i o n ( S S 田 p e

6、面m e do n t h ec D N A so ff e n i l e y 0 吼gp a I l i c l e a n ds t 矾l e y o u I l gp 弛i c l eo f m e n n 0 一s 哪i t i v eg e n i cm a l es t e r i l er i c e ( T b 7 S ) 3 9p o s i t i v ec l o n e s 丘哑也e 蜘i l c S u b 仃a c t i v ec D l 姐l i b r a r ) ，h a db e 如s e l e c t e df o rs e q u e n c m

7、ga I l dB L A S T a 加1 p i s ，b u t 廿1 c y h a dn o tb e e ni d e n t i f i e db yI 沁V e r s eN o r C h e mD o t - B l o t I I lt l l i sr e s e 鲫m3 7c l o n e sw e r es e l e C t e d 舶mt l l e3 9c l o n e st 0b ei d e 以丘e db y 哪i I 唔 血em e t h o do fI h e r s eN o r n l e mD o t - B l o ta n do b t

8、 a i l l e d1 1c l o n e st h a te x p r e s d d i 丘e r e n t i a n yi I lm ey o u n gp a n i c l eo ft l l e m l 0 - s e n s i t i V eg e I l i cm a l es t e r i l er i c cb e t w e e n 血c T b 7 S Fa I l dT b 7 S S A c c o r d i I l gt 0t h er e s u no fI 沁V e r s eN o m l e mD o t - B l o t ，f i v

9、 eg e n e sm 础甜O s 2 4 3 ， O s l 8 3 ，O s 3 7 1 ，O s 4 0 8 ，O s 3 4 8t h a te X p r e s sd i 妇f e r e n t i a l l y i t lt h e y o u I 培p a n i c l eo f t h e 咖o - s e n S i t i v eg e I l i cm a L l eS t e r i l er i c eb e 帆恤T b 7 S Fa n dT b 7 S - S 船s e l e c t 嬲血e t a r g e tg e n e st 0c o n S

10、 n 眦t eR N 舡纽dV o e r - e X p r e s s i o nV e c t o r s T h ef 0 u rg e sO s 2 4 3 ， O s l8 3 ，O s 3 7 1 ，O s 4 0 8w e r eb l a s t e di I lm er i c c 如l l l e n g t l lc D N A 胁a b 蹴缸df m da 触g m e m t l l a td i dn o tl l a v et l l es a m ec o 璐e c u t i V e2 lb a s e s 而t I l0 t h e rr i c eg e

11、 s 嬲R N 础 f 岍e n tn a m e d 鼬O s 2 4 3 ，m O s l 8 3 ，I U O s 3 7 1 ，m O s 4 0 8 P r i m e r Sw e r ed e s i g n e dt 0a n l p l i 匆 t l l es e l e c t I 斑g e n e s 锄dI 斟越丘a g m e 鹏T h es e q u e n c i n gr e s u l t so ft l l i sg e 舱sa n dI 矾舡 丘a g m e n t ss h o w e d l a tg e n e sO s l 8 3 ，O s

12、4 0 8 ，O s 3 4 8a l l dR N A j 如鄹橱俺斑O s 2 4 3 ， 鼬O s l8 3 ，硒O s 3 7 1 ，m O s 4 0 8h a V eb e e nc l o n e dc o 玎e c t l y 。 T h ep l a S 耐dp T C K 3 0 3 、V 鹤鹤血eb a c k b o n ef o rc o n g 咖c t i I l gR N mV e c t o 瑙强do V * e x p r e s s i o nV e c t o r S T W o - s t e pc l o m n gm e t h o d 、e r

13、eu S e df o rR N A iv e c t 0 墙c o m 觚c t i o 玛 t l l ef i r s tS t e p ：也et a r g e t e dR N 础丘a 咄幽w e r el i g a t e dd i r e c t l yi I lm ep T c 豳0 3 肌d 也e s e c o n d ：t 1 1 et 鹕e t e dR N A i 曲g m e n t sw e r el i g a t e dr e V e r s e l yi I l 也eh l t e 咖e d i a t eV t o l s ，a t l a S tf 0

14、 肌e da ni I l V e r t e dr e p e a ts 印a r a t e db yt h er i c ei n t r o n T h er e s u l t So ft h ed i g e s t i o nb y e r u 可m e ss h o w e dm eR N A iV e c t o r sh a db e e nC 0 n s 廿u C t e ds u c c e s s f u u ya n d 咖e d p T C 飚0 3 - 慰O s 2 4 ，p T C 硒0 3 础O s l 8 3 ，p T C 飚0 3 一硒O s 3 7 1

15、a I l dp T C 融0 3 对0 s 4 0 8 。T h e g e 鹏sO s l8 3 ，O s 3 7 1 距dO s 3 4 8t l l a th a db 啪c I 蚰o di nt h ep M D l 8 - Tp l a S m i d sa n d 让圯 p T C 硒0 3w e r ed i g e s t c db ye m ：舯蝎也e 切r g e 脚胂瞄a n dD N A 触班e n t s 舶m p T C 硒0 3 v c I c t o r s w e r e 叫f i e d ，l i 倒谢a n d 如mo 删托x 印s s i o nV e

16、 c t o r s ，t l l e n 俩1 s f o n n a t e d 髓D ，f D H 5 a 也er e s u l t So f 她d i g e S 吐o fr e c o m b i l l 姐tp l a s m i d ss h o wt l l a ：t 圮o v e r - e x p r e s s i o nv e c t o r sh a db e e n 铡n s t m c t 姐m c c e s s 矗l l l ya n d 咖e dp T C 硒0 3 - O s l 8 3 ， p T C I ( 3 0 3 - O s 3 7 1 锄dp

17、 T C 硒0 3 一O s 3 4 8 A g 印b a c t e r i 眦t n e f a c i e n sL B A 4 4 0 4h b o r i n gt h eR N A i v I t o r so ro V e r - e x p r e s s i o n v c c t o rw 鄱璐e df o rr i c e 仃a n s f o m a t i o nA f l e ri n f b 舐b yt h eA g m b a 涮啪眦f a c i e 璐 L B A 4 4 0 4 ，R N A i6 嘲皿e n t sa n dg e m s 咖b e 蛔出

18、硒m e di n t 0a c c 印t e dm a t I e r i a l s A f t e r t v v i c er e s i s t a n c cs e l e C t i o n s ，t r a I l S g e n e 此默：血培啪b e 衄讯而a t e di I ld i 舵r e n t i a t i o n c u l t l l r em e d i 啪I nt 1 1 i sr e s e a r c h6 缸娜g e n e t i cr i c e sw 骶ob t a ：m e d mr e s u l to f m eP C R 趾a l

19、y S i sd e n l o n 删e dt l l a t 也eg e n eO s 3 7 lh a di n 耐e di n 也e r i c eg e n o m e 1 蛔rw o r d s ： r i c em I e m l 0 - s e n s i t i v eg e n i c 删es 删eR N o v a H x p r e s s i o n n a r 塔f o n l l a t i O n m 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的

20、内容外，本论文不台任阿其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明 本声明的法律结果由本人承担。 黼獭勰强 吼妒P 年“铀 言簸瓣蠹始贸日期：沙，多年多月舌日日期：加汐矿，年名月乡白 本人已经认真阅读“C A L I S 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论 文提交“C A 乙I S 高校学位论文全文数据库”申全文发布，并可按- 权益。旦童迨塞堡銮匿鲎唇：旦坐生；旦= 生；堕兰釜筮查。 亲二作者签名：钍缎 日期：加妒年f 月目 章程”中规定享受相关 ：言雾：日期：喵 l 前言 水稻是全世界主要粮食作物之一。2 0

21、世纪5 0 一年代，水稻常规育种取得了辉煌 成就。水稻矮杆育种和杂交水稻技术使世界水稻产量从1 9 6 6 年到1 9 9 0 年增加了一倍， 为不断增加的世界人口提供了足够的食物来源。但据估算，到2 0 2 5 年，水稻的产量 必须再增加6 0 ，才能满足人口增长的需要。因此高产育种将是近期农业研究的主要 目标。光温敏雄性核不育水稻在杂交水稻生产和研究中具有极其重要的地位。生产实 践表明与三系杂交水稻比较，其应用上具有如下优势：恢复面广，配组自由，能充分 发挥水稻品种间和亚种间的杂种优势；遗传行为简单，不育性由l 2 对核隐性基因 控制，不育特性易于转育，可以把不育基因导入不同的优良品种或特

22、异种质中，育成 不同类型的核不育系；核不育水稻的细胞质为正常细胞质，无细胞质效应，避免了细 胞质基因所带来的感病性等危害：核不育系的繁殖比较容易，简化了繁殖程序，从而 克服了三系杂交稻育种程序和生产环节复杂，新组合选育周期长，效率低：推广环节 多速度慢：种子成本高，价格贵的弊端。并以此为基础广泛开展的亚种间杂种优势利 用表现出潜力更大的增产优势。不仅如此，光温敏雄性核不育水稻还是很好的生理生 化、遗传、分子生物学研究材料，表现为在遗传背景完全相同的前提下，育性的转换 与调控严格受外界环境的影响，对基因表达与调控、育性转换过程中的生理生化变化 机制等研究具有重要的意义。 1 1 水稻雄性不育的研

23、究进展 雄性不育( m a J es t e r i l i 饥M S ) 是指雄性器官退化、发育不良或花粉、精子败育不 能行使生育能力而雌蕊发育正常的现象( 朱英国，2 0 0 ) 。雄性不育是植物中普遍存在 的现象，在高等植物中，约有4 3 个科1 6 2 个属约6 2 0 个物种具有雄性不育现象，在 检测过的3 9 种植物中就有2 8 种具有该现象( K 砌，1 9 9 8 ) 。雄性不育对生物本身是一 种不利性状，但在自然界中也是植物进化，特别是白花授粉植物进化过程中的一种特 殊的生存方式。它迫使植物接受外来花粉，从而在生长势和适应性方面产生强大的杂 种优势，人们利用这一现象提高农作物

24、的产量、质量和抗性。 1 1 1 水稻雄性不育性的分类 K a u l ( 1 9 8 8 ) 将植物雄性不育性分为遗传型和非遗传型两大类。而遗传型雄性不育 性，又分为表现型和基因型两种类型。表现型雄性不育性可分为孢子发生型、细胞质 雄性不育性和功能型三类；基因型雄性不育性可划分为细胞核雄性不育性、细胞质雄 性不育性和核质互作型雄性不育性。同样，水稻雄性不育有遗传型不育和非遗传型不 育两种。遗传型不育是指由内在的遗传物质决定，其不育是受遗传基因控制的；而非 遗传型不育是由于外界异常因素诱导而造成的不育。在生产上广泛应用的三系不育系 以及两系不育系都是遗传型不育。遗传型不育又可分为细胞质不育、细

25、胞核不育，以 及质核互作型不育三种类型。其中细胞质不育指不育性仅受细胞质基因控制，与核基 因无关。单纯由细胞质控制的不育性由于找不到恢复系，所以在生产上没有实用价值。 细胞核不育是指不育性仅受核基因控制，与细胞质无关。这种类型的不育性，一般只 受一对隐性核基因控制，育性正常的都可以作为它的恢复系，没有保持系，其育性得 不到完全的保持，故无法直接利用。质核互作型不育是指不育性是受细胞质基因和细 胞核基因共同控制，当其细胞质和细胞核均为不育基因时才表现为不育。这种不育类 型既有保持系( 质为可育基因，核为不育基因) ，可以使其不育性得以保持，又有恢 复系( 质可育或不育基因，核为可育基因) 使得其

26、F l 杂种育性得以恢复正常，实现三 系配套，因此能在生产上直接利用。然而，长期的育种实践表明，完全单纯由细胞质 控制的不育实际上还没有发现。因此在实际应用中通常意义上讲的细胞质不育，实际 上指的是质核互作型不育( 朱英国，2 0 0 0 ) 。因此，综上所述，从育种实践上来讲， 水稻雄性不育总体上可划分为两大类，细胞质雄性不育和细胞核雄性不育，光温敏细 胞不育是属于细胞核不育的范畴的。 1 1 2 水稻雄性不育的生理生化基础 1 1 2 1 能量代谢系统与水稻雄性不育 植物中有多条呼吸途径，有氧呼吸是主要途径。有氧呼吸包括三羧酸循环，电子 传递和氧化磷酸化等过程。水稻雄性不育株花药中与这些过

27、程有关的多种酶的活性普 遍降低。三羧酸循环涉及到多种酶，包括线粒体基质标志酶琥珀酸脱氢酶。细胞化学 研究表明，水稻雄性不育花药中的琥珀酸脱氢酶活性低于可育花药，不育花药的苹果 酸脱氢酶活性低于可育花药，但苹果脱氢酶不只是存在于线粒体中，其它细胞器中也 有，实测的水稻不育株花药的酶活性降低并不一定是线粒体的苹果酸脱氢酶活性降低 的结果( O l l I n 嬲aM ，1 9 8 2 ) 。细胞色素氧化酶是线粒体内膜标志酶，电子传递链的末 2 端氧化酶。这种核质共同编码的酶的同工酶带数是不育花药少于可育花药，细胞化学 方法研究表明：水稻雄性不育花药的细胞色素氧化酶活性低于可育花药( 舒孝顺， 1

28、9 9 9 ) 。舒孝顺等( 2 0 0 0 ) 用温敏不育水稻N 1 0 S 、N 1 3 S 、1 3 5 6 S 和衡农S - 2 所做 的工作最能说明细胞色素氧化酶活性与雄性不育株育性之间的关系。在它们的幼穗 中，两个育性敏感时期，不同育性条件下，酶活性没有显著差异，但不育花药中的细 胞色素氧化酶活性极显著低于可育花药，只有可育花药的6 0 7 0 ，它们的幼穗 在两个育性敏感时期，可育花药的细胞色素氧化酶活性和常规品种特青、紫壳花药中 的酶活性很接近而且比较高。 三磷酸腺苷酶也是能量代谢中的一个重要酶，细胞化学方法研究结果认为水稻雄 性不育株花药的三磷酸腺苷酶活性低于可育株花药。但是

29、，用生化方法测定的结果表 明，花药单位重量的蛋白质中三磷酸腺苷酶活性是雄性不育株花药高于可育株花药 ( 黄厚哲等，1 9 8 4 ) ，如果以单位重量的花药表示则不育花药的酶活性仅为可育株花 药的l 3 。出现这种现象，主要是由于雄性不育株花药的可溶性蛋白质含量降低较多， 而膜结合的结构蛋白质降低较少的缘故。实际上以单位重量花药而论，不育花药的酶 活性是降低了。此外，伴随着雄性株花药呼吸强度降低的还有磷酸化强度和氧化磷酸 化效率的降低。可见，水稻雄性不育株花药中，三羧酸循环和电子传递链的酶活性降 低，氧化磷酸化效率降低，必然会减少花药中的能量形成，使得能量供应短缺。王培 。 田等( 1 9 8

30、 3 ) 认为雄性不育株花育中的能量供求不平衡是造成雄性不育的原因。 1 1 2 2C a 2 + 信使与水稻雄性不育 C a 2 + 作为第二信使在植物细胞内起着广泛的作用，各种外界与内在信号因子( 如： 触动、光、冷胁迫、盐碱胁迫、热敏反应、激素等) 所导致的细胞内反应都被证明与 C a 2 + 浓度变化有关。近年来对C a 2 + 信号转导与水稻雄性不育机制的研究也日益受到重 视。 吴文华等( 1 9 9 3 ) 研究指出，在红光及长日照处理下，农垦5 8 S 在幼穗发育的 第期到第V 期，叶片中可溶性C a 2 + 含量升高，叶绿体中C a 栅a s e 活性下降，表 现出与短日照及远

31、红光处理完全相反的变化，这说明叶片中可溶性C a 2 + 含量和叶绿体 C a 2 + A T P 嬲e 活性变化与农垦5 8 S 的育性转换有关。用焦锑酸钾沉淀法对H P G M R 的可育和不育花药进行钙定位研究( H u ie ta l ，1 9 9 8 ) 发现在可育花药中的小孢子发 育晚期，在花药壁内和花粉与乌氏体表面积累丰富的钙，而在花粉粒的胞质中不积累； 在花粉中积累淀粉粒后，花粉壁上的钙减少，而薄壁细胞中钙增加。在花粉不育的花 药中，花药中层和药室内壁积累丰富的钙，而在绒毡层中不像可育花药那样丰富。在 不育花药中间层和绒毡层之间出现特殊的细胞壁，这与特异性钙积累有关，因而在药

32、室中缺少有壁的花粉。这表明钙分布的异常与花粉发育衰退及败育有关。杨代常 ( 1 9 9 0 ) 测定结果表明，农垦5 8 S 中磷酸化酶的活性受C a 2 + 浓度影响较大，对C a 2 + 浓 度变化敏感；在农垦5 8 S 育性转换过程中，体内的磷酸化酶活性是长日照处理高于 短日照处理。由于磷酸化酶催化一些蛋白质的去磷酸化反应，而C a 2 + 仰a 辩催化 磷酸化反应，这初步表明，光敏色素参与调控农垦5 8 S 育性转换可能是以磷酸化和 去磷酸化的方式进行的。于青等( 1 9 9 2 ) 对农垦5 8 S 在幼穗发育的期叶片C a ， 总含量及叶片细胞内C a 含量及C a M 含量的变化

33、进行测定，表明雌雄蕊形成期 ( ) 和花粉母细胞形成期( V ) 是农垦5 8 S 对光敏感的两个时期，长日照在此时 期引起叶片中C a 2 + 含量的变化，特别是使细胞内C a 2 + 含量的增加，表明C a 2 + 与 光信号的关系密切；在短日照处理中，叶片内C a M 含量从V 期开始上升，并在和 期维持在相对较高水平，比同期的长日照叶片含量高，这种较高水平的C a M 含量 可能是保证这几个时期农垦5 8 S 正常发育所必需的，因而长日照下叶片中C a M 含 量明显不足与花粉败育可能有内在联系。在短日照下的农垦5 8 S ，经E G ，r A ( 乙二 醇双乙胺醚一N ，N 四乙酸，

34、C a 2 + 螯合剂) 、C P Z ( 氯丙嗪，C a M 抑制剂) 处理后， 均使花粉育性下降，结实率降低。长日照下的农垦5 8 S 经E G T A 和C P Z 处理后， 均使花粉育性部分恢复( 可育花粉率为1 3 2 和1 4 3 ) ，结实率为零，但在长日照下 喷施C a 2 + C a M 溶液后，可育花粉率为5 4 1 ，结实率为4 6 8 ，即C a ? + - C a M 处 理使农垦5 8 S 在长日照下育性得到8 3 3 的恢复。由此可见，C a 2 + - C 蝴系统在决 定农垦5 8 S 育性表达中起着极为重要的作用。 1 1 2 3 植物生长物质与水稻雄性不育

35、1 1 2 3 1 赤霉素 张能刚等( 1 9 9 2 ) 以农垦5 8 S 和双8 1 4 S 为材料，在育性转换敏感期检测了幼 穗和倒二叶中G A s 的含量。在农垦5 8 S 颖花原基分化期，不同光照处理的Q 虹含 量迅速下降；在雌雄蕊形成期至减数分裂期，长日照处理的G 舡含量明显低于短日 照处理，以花粉母细胞形成期差异最大：在花粉完熟期，G A s 含量显著下降，而短 日照处理却急剧上升，对照品种农垦5 8 在不同光照处理下的各个发育时期的G 缸 4 含量变化趋势基本一致。这表明G 缸参与了农垦5 8 S 的育性转换过程。童哲等 ( T 0 n gz h ee ta l ，1 9 9

36、0 ) 在育性转换期检测叶片中G A s 的含量，结果表明，短日照 处理的G A s 含量高于长日照处理，而对照品种农垦5 8 在长、短日处理下叶片中 G A s 含量没有这么大的差异，与张能刚的研究结果一致。赵玉锦( 1 9 9 6 ) 报导，无 论是农垦5 8 ，还是农垦5 8 S ，在长日照处理后同期生殖器官中G 缸的含量均低于短 日照处理。扬花期正常发育的水稻花药中内源G A l 和G A 4 呈现大量积累的趋势，花 粉已败育的农垦5 8 S L D 内源G A I 和G 水平却显著降低。这暗示G A s 的亏缺与 水稻雄性不育可能有关。 游年顺等( 1 9 9 7 ) 比较同核异质体

37、雄性不育系w A L v 4 l A 、W W 4 l A 和保持系 V 4 1 幼穗和倒二叶鞘中G A l + 3 姗7 的含量，指出不育系w = A V 4 l A 、w w 4 l A 幼穗分 化过程中，G A l + 3 + 4 + 7 含量低于保持系。在细胞质雄性不育系珍汕9 7 A 和保持系珍汕 9 7 B 中有类似的结果( 田长恩，1 9 9 8 ) 。在幼穗发育的雌雄蕊形成期到三核花粉期( 花 粉完熟期) ，不育系和保持系中G A l + 4 含量均表现出先升后降，但保持系中G A l + 4 含 量明显高于不育系。用人工合成的化学杀雄剂T 0 3 处理正常水稻，测定水稻幼穗、

38、 叶片中G A s 含量的变化发现，经T 0 3 处理后的幼穗、花药和叶片中G A s 含量明显 减少，这与水稻细胞质雄性不育和核不育方面的研究结果一致( 汤日圣等，1 9 9 6 ) 。 由此进一步表明，G 触可能是引起水稻雄性不育的直接原因之一。 Q 铀与水稻花药发育和花粉成熟密切相关( 1 渤a y 枷e ta L l ，1 9 8 8 ) ，水稻幼穗中 保持高含量的G A s 水平是保证幼穗发育和花粉正常所必须的。G 触对叶片中L 诅 水平变化起主要调控作用，可以抑制L 蛆氧化酶或过氧化物酶的活性，促进色氨酸 转为L 蚣，使结合态L 认转为游离L 蛆，提高植物体内L 认水平。 1 1

39、2 3 2 生长素 生长素类物质是植物生长发育所必需的，分布于植物体的各个部分，花和叶片则 是L 诅合成的主要部位，它对于调节植物基因转录和酶的活性起着重要作用。黄厚 哲等( 1 9 8 4 ) 研究了细胞质雄性不育系和保持系中L 认含量与雄性不育发生的关系， 发现队A 含量与可育度平行下降，而不育系花药中L 蛐氧化酶和过氧化物酶活性却 随着不育度提高而上升，提出雄性不育的发生在于不育花药中L 认库受到破坏，姒 严重亏损，而导致花粉败育。游年顺等( 1 9 9 7 ) 以胞质不育系W A V 4 1 A 、w v V 4 l A 和 V 4 1 B 为材料，田长恩等( 1 9 9 8 ) 以胞

40、质不育系珍汕9 7 A 和保持系珍汕9 7 B 为材 料，对比了幼穗、花药和叶片中队A 含量的变化，得到与黄厚哲相似的结果，再次 证明I A A 含量的变化与胞质雄性不育有关。 徐孟亮等( 1 9 9 0 ) 指出，农垦5 8 S 在长日照处理下叶片中游离认A 含量在幼 穗发育的不同时期呈现上升趋势；而同期在幼穗和花药中队A 含量却表现出严重亏 损。杨代常等( 1 9 9 0 ) 以肿L C 方法分析了农垦5 8 S 在不同光照处理下的L 认含 量，得到与徐孟亮等相反的结果，在幼穗发育不同时期，叶片和幼穗中L A A 在长日 照处理下发生严重亏损，其含量明显低于短日照处理。他们认为L 蚺在长日

41、照下的 严重亏损，进而引起其它激素的代谢调整，破坏了激素间的平衡关系，从而影响了育 性的正常表达。张能刚等( 1 9 9 2 ) 用E U S A 检测分析了农垦5 8 SL 蛆的变化规律： 在雌雄蕊分化期，无论是长日照还是短日照，幼穗中L A A 的含量都很高；进入花粉 母细胞形成期后，长日照和短日照处理的幼穗中L 认含量急剧下降，随后逐渐稳定， 但农垦5 8 S 各时期幼穗中L 蛆含量均表现为长日照处理低于短日照处理，而叶片 中L A A 的含量却表现出不同的规律，从颖花原基分化期至花粉母细胞减数分裂期， 长日照处理叶片中I A A 含量始终很低，而短日照处理的农垦5 8 SL 蛆含量保持

42、一 种较高的水平，随着生育期的推进，L 认氧化酶活性呈升高的趋势，在长日照处理 下各时期I A A 氧化酶活性均比短日照处理的高。赵玉锦等( 1 9 9 6 ) 用气相色谱一质 谱联用选择离子检测技术，以农垦5 8 S 和农垦5 8 为材料，得到与张能刚相类似的 结果。 用一定浓度的外源生长物质L 诅、三碘苯甲酸及玉米素加三碘苯甲酸组合处理， 能使农垦5 8 S 在完全不育的条件下达到部分可育( 林友豪，1 9 9 6 ) ，原因可能是通过 补充外源激素影响农垦5 8 S 叶片与幼穗内源L A A 的含量而达到部分可育。用 3 H L 蛆饲喂农垦5 8 S 倒二叶，发现3 H 队A 从农垦5

43、8 S ( 短日照) 叶片中的输出 量比长日照下多5 0 ，而用L A A 运输抑制剂T m A 涂布在农垦5 8 S ( 长日照) 叶 片基部，也明显抑制该叶的3 H L 认输出，导致其自交结实率明显下降，这暗示着 从功能叶片输入幼穗的L 蛆含量可能取决于日照长短( 于青等，1 9 9 2 ) 。 1 1 3 水稻雄性不育的分子机理 1 1 3 1 细胞质雄性不育 细胞质雄性不育( c y t o p l 硒m i cm a l es t e r i l 时，c M s ) 是广泛存在于高等植物的现象，表 6 现为雄性器官不能形成有活力的花粉，而雌性器官的发育和植株的营养生长正常，其 遗传方

44、式是母性遗传。C M S 不仅在植物杂种优势利用方面具有重要的作用，而且也 是遗传学研究的好材料，因此，对植物C M S 的研究也一直受到遗传学、育种学、生 理生化、细胞生物学、分子生物学等各个领域的广泛关注( S c h n a b l ee ta l ，1 9 9 8 ) 。目 前，大量的遗传学、细胞学和生物化学的研究结果证明线粒体基因组的变异与C M S 有关，线粒体基因组的变异或特异的线粒体基因表达会导致雄性不育( H a I l s o 玛1 9 9 9 ； B l l d 龃e ta l ，2 0 0 l ；B u d a re ta l ，2 0 0 3 ) 。 C M S B

45、o mI I 型水稻线粒体基因组中存在两个拷贝的卿6 ( A r P 鹤es u b u I l i t6 ) 基因，分别命名为印坩和口印珩。早在9 0 年代，几个研究小组报道C M S B o r oI I 和 异常的线粒体基因B 唧蝤有关( K a d o 戳l k ie ta l ，1 9 9 0 ；1 w l b I l 曲ie ta l ，1 9 9 3 ) ，良印巧 转录一个异常的d N A 转录本，这个转录本包含一个共转录的阅读框D 7 ：汐，o ，歹7 9 可 能编码一个跨膜蛋白且C 端和N 端与水稻线粒体细胞色素氧化酶亚基I 同源 ( 蛳e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。

46、许多学者都认为这个异常的转录本引起细胞质雄性不育，但都 没有实验证据证明C M S B o r 0 是由口印恬基因异常转录造成还是由其下游序列 。椰的转录造成。 W 锄g 验证了D 矿7 9 的作用，他把矽9 转到大肠杆菌中，D 护蛋白的表达使大 肠杆菌细胞裂解而导致其数量和密度快速下降，表明。咿是个毒素蛋白。D 护蛋白 毒性必须依赖C 端5 个氨基酸的存在，把这5 个氨基酸切掉，则毒性消失。W a I l g 继续检验是否D 7 9 引起水稻雄性不育。他把带有线粒体转移信号的删基因转入 正常可育水稻中，T o 代表现半不育。可见是D 枷引起水稻细胞质雄性不育。此外， 免疫杂交分析表明，虽然D

47、 ，厂7 9 基因是组成型表达，但是其蛋白只在c M S 系的小孢 子中积累，在孢子体组织中都没表达，因此推论可能是转录后调控机制抑制D 7 9 蛋 白在孢子体组织中表达，D 护才不影响孢子体组织的发育( W a n ge ta l ，2 0 0 6 ) 。 w a n g 继续寻找育性恢复的分子机制，他通过图位克隆定位了一段3 7 k b 的染色体 区域，测序后发现这段染色体包含两个编码P P R ( p e 北晡c o p e p t i d er e p e a t ) 蛋白的基 因足口和印6 。通过互补测验发现，彤7 口和职6 都能恢复C M S B o r 0I I 育性。 明口和印

48、6 蛋白通过不同的机制破坏D 椤产物进行育性恢复。印口通过介导核 酸内切酶在三个位置切割男一印舶矿9l n 】5 琳A ，而明6 通过介导的B 口鲫枷 m I 矾A 降解。f 沪口对彤7 6 显性，当两个基因同时存在时，口口矽铂7 = 厂7 9m R N A 优 先被明口切割，切割后的产物对明6 不再敏感( W 魂e ta l ，2 0 0 6 ) 。 7 1 1 3 2 细胞核雄性不育 水稻花粉发育过程是一个复杂的过程，有许多基因参与，这些基因的突变都可能 导致花粉的不育。目前在水稻中克隆到的细胞核雄性不育基因都是花粉发育相关基 因，这些基因参与花粉囊蜡、绒毡层发育，胼胝质沉积，小孢子母细胞

49、的减数分裂和 花药的开裂等。 1 1 3 2 1 花粉囊蜡发育相关基因与雄性不育 植物蜡主要由醇类、醛类、酮类、烃类、酯类组成，这些成分都是由长链脂肪酸 ( v e 驴l o n g - C h a i l lf a t t ) ra C i d s ，V L F 缸) 衍生而来的，链长度在2 0 3 4 个碳原子之间 ( K 1 m s te ta l ，2 0 0 3 ) 。蜡是角质层的主要组成成分，是陆生植物地上部分的疏水屏障。 表皮蜡的主要功能是防止水分流失( m e d e r e re t 地2 0 0 1 ) ，抵抗细菌和真菌的感染 ( J e l l k sc ta l ，1 9 9 4 ) 。 在被子植物中，花粉囊壁由4 层组成：最外面是表皮层，然后是药室内壁、中层， 最里面是绒毡层。表皮层上还有一层角质层，角质层由上表皮蜡质层和角质膜层组成。 角质层在抵抗各种环境压力尤其是在防止水分散失是非常重要的。最里层是绒毡层， 在绒毡层中有