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1、艾滋病病毒学与致病机理基础入门问答1、及时发现并鉴定HIV各种亚型有何重要意义？A、追踪流行趋势B、开发有效的检测试剂和疫苗C、研制有效的临床治疗药物2、HIV对下列环境中的哪些物理因素和化学因素抵抗力较弱？A、高温B、酒精C、紫外线通常人们对一种疾病的认识总是从症状开始，依据类推比较的原则和体内外反复实验研究，最后明确导致这种疾病的病因。艾滋病也不例外，人们在发现艾滋病病人数年后分离出艾滋病病毒(HIV)，二十余年后的今天，HIV是引起艾滋病的病原体已成为一个不争的事实。艾滋病(AIDS)目前虽然没有治愈的方法，但已经可以通过特异性抗病毒治疗改善病人症状，延长生命，降低发病率和死亡率。第一节
2、艾滋病病毒的分类一、艾滋病病毒“家族”从病毒“大家族”分类来说，HIV属于逆转录病毒科。HIV在病毒“大家族”中的定位是逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。HIV自身的家族成员包括HIV-1和HIV-2。HIV-1分为M、O、N亚型组。M亚型组包括A、A2、B、C、D、E、F1、F2、G、H、J、K亚型。O亚型和N亚型很少见。HIV-2主要局限于西部非洲和西欧，北美也有少量报告。HIV-2有A、B、C、D、E、F、C亚型，它的生物学特性与HIV-1相似，但毒力较弱，感染导致的病程较长，症状较轻。及时发现并鉴定HIV各种亚型对于追踪流行趋势，准确做出诊断，开发新的药物筛选方法和有效的检测
3、试剂和疫苗，研制有效的临床治疗药物均具有重要意义。在我国流行的毒株主要是HIV-1，HIV-2仅有个别报道。1999年在福建和上海发现并证实我国有HIV-2感染者，在华中、华南和西北几个省区也有血清学证据提示可能存在HIV-2感染者。我国HIV-1流行株的分布见表2-1。 二、艾滋病病毒的结构、功能及其临床意义(一)病毒颗粒HIV呈球形，直径约100120nm。典型的HIV-1颗粒由核心和包膜两部分组成，核心包括病毒RNA、核心结构蛋白和病毒复制所必须的酶类。HW的RNA为两条相同拷贝的正股RNA链。病毒复制必须的酶类有3种，分别是逆转录酶(p66，p51)、整合酶(p32)和蛋白酶(p11)
4、。核酸外面为病毒衣壳蛋白(p24，p17)。病毒的最外层为包膜，其中嵌有gp120和四41两种特异性糖蛋白，前者为外膜糖蛋白，后者为跨膜糖蛋白(图2-1)。 (二)结构基因HIV基因全长约9.8kb，含有gag、pol、env3个结构基因、2个调节基因和4个辅助基因，分别称为tat(反式激活因子)、rev(毒粒蛋白表达调节子)；ncf(负调控因子)、vpr(病毒r蛋白)、vpu(病毒u蛋白)和Vif(毒粒感染性因子)。HIV-1的基因结构见图2-2。(三)临床意义HIV的结构成分与病毒感染、临床诊断、药物、试剂和疫苗的研究密切相关。如包膜糖蛋白是病毒进入细胞的门户，针对各种病毒抗原(gp120
5、、gp41、gp24等)而产生的抗体是临床诊断的重要物质基础。三、艾滋病病毒在外界环境中生存能力HIV一旦离开宿主在外界环境中生存能力便很快消失，HIV对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱，比乙型肝炎病毒(HBV)的抵抗力低的多。因此，对HBV有效的消毒和灭活方法均适用于HIV。(一)HIV对温度的抵抗力HIV对热很敏感，对低温的耐受性强于高温。因此，可以用高温灭活HIV，在低温条件下保存HIV。1. HIV灭活：美国CDC证明干燥环境中的HIV活性在几小时内降低90%99%。在室温(2227)液体环境下HIV可存活15天以上；经56处理30分钟可使HIV在体外对人T淋巴细胞失去感染性，但
6、不能完全灭活血清中的HIV；血清中HIV经过603小时或8030分钟作用后不能检出感染性HIV。目前，WHO推荐的逆转录病毒灭活方法是10020分钟。2. HIV保存：在-70条件下，不加保护剂冷冻，HIV可丧失感染性。若在-70条件下保存于35%山梨醇或50%胎牛血清(FBS)中可存活3个月以上。在液氮中(-196)HIV可存活数年以上。因此，毒种必须置于液氮中方可长期保存。(二)HIV对化学品的抵抗力1. HIV耐碱不耐酸在pH3.0条件下HIV滴度在10分钟可下降4个对数级，而pH值高达9.0时，HIV滴度下降甚微。2. HIV对化学因素很敏感0.5%次氯酸钠或70%酒精在室温中，只需1
7、分钟即不能检出RT酶活性0.2%次氯酸钠、0.1%家用漂白粉、0.1%戊二醛、0.5%NP40、0.5%多聚甲醇等5分钟即可灭活HIV30%酒精溶液5分钟可灭活HIV20%酒精溶液10分钟可灭活HIV0.08%氯化氨在10分钟内使HIV滴度降至检出水平以下0.1%羟丙酸-丙醇(BpL)、1：1000甲醛、50%乙醚、0.5%三硝基甲苯X-100均可使1(104107)感染剂量的制品中HIV全部灭活去垢剂NP40在制备病毒蛋白时常规使用，HIV对其抵抗力很弱，HIV接触NP40 1分钟内，其传染性降低8个对数级TCID50冷丙酮或甲醛及丙酮标本经其固定，可使标本中HIV灭活吐温20(2.5%)对
8、HIV无灭活作用3.紫外线或丁射线不能灭活HIVHIV对紫外线或射线不敏感，紫外线或射线不能灭活HIV病毒。第二节艾滋病病毒在人体内的复制一、进入易感细胞的途径(一)易感细胞体外培养表明多种人类细胞对HIV易感，但感染范围因不同病毒株而不同，见表2-2。一般来说，CD4+细胞可以使HIV复制达到最高滴度。(二)进入易感细胞的通道HIV需借助于易感细胞表面的受体方可进入，包括第一受体(CD4，主要受体)和第二受体(辅助受体)。HIV的外膜糖蛋白gp120首先与第一受体CD4分子结合，gp120的多个CD4结合决定簇在结合时互相影响，使gp120与CD4+结合时发生构象改变。然后gp120再与第二
9、受体(趋化因子)结合，使HIV与CD4+细胞进一步靠拢，gp120构象进一步改变，并与gp41(gp36)分离，暴露出的gp41(gp36)插入CD4+细胞膜中，最终导致HIV与宿主细胞膜的融合，并释放病毒内容物到CD4+细胞中。HIV胞膜是体液抗体反应的主要靶位，胞膜糖蛋白gp120和gp41有很强的抗原性，与抗体中和作用有关，也是免疫疫苗研究的靶点之一。早期的研究表明HIV通过与宿主细胞表面的CD4分子结合感染细胞，20世纪90年代后大量的研究证明HIV感染细胞仅靠CD4是不够的。1996年人们发现了HIV感染的辅助受体，即HIV与CD4分子结合后再通过辅助受体方可进入细胞。目前，已经发现
10、的与HIV感染有关的辅助受体有2类，一类是CC型辅助受体，如CCR1、CCR2b、CCR3、CCR5；另一类是CXC型，如CXCR4。辅助受体的发现为人们进一步从分子水平了解HIV的发病机制打开了新的通道。至此，HIV生物学特性的研究进入了分子时代。CCR5是最主要的第二受体。第二受体基因在不同人种中遗传的突变率有明显差异，缺乏第二受体表达的个体似乎对HIV-1感染有一定的抵抗力。这就是为何有些人反复多次与HIV-1感染者发生性行为而未感染，或有些HIV-1感染者长达15年以上未出现临床症状，其中有一部分就是具有缺损的CCR5，造成细胞表面CCR5分子减少，从而减低对HIV-1易感性。(三)病
11、毒-细胞融合HIV-1主要通过与宿主细胞膜直接融合进入细胞，而不是通过吞噬作用。HIV-1作用于培养的细胞、无细胞融合现象的毒株称为NSI型(non-syncytium inducing)；引起细胞融合的毒株称为SI型(syn-cytium inducing)，表现为合胞体形成。一般SI型与T细胞嗜性有关，多见于艾滋病患者；NSI型多见于HIV的早期感染者。(四)病毒进入缺乏CD4表达的细胞的机制没有CD4受体的人体细胞(脑、肠、阴道细胞)也可以感染HIV。HIV是通过这些细胞上半乳糖苷神经酰胺(GalC)受体来感染这些细胞的。这个受体是一种糖脂，可结合在病毒gp120(V3环)的不同区域，从
12、而细胞被感染。此外，研究发现HIV还可能通过如MHC相关分子、淋巴细胞的功能抗原I型(LFA-1)、Fc和补体受体介导等其他机制进入细胞。二、HIV在易感细胞内的复制(一)吸附及穿入HIV-1感染人体后，病毒选择性的吸附于靶细胞的CD4受体上，病毒包膜发生构象改变，外膜糖蛋白gp120的V3区与宿主细胞的CCR5或CXCR4结合，引起跨膜糖蛋白gp41区段与靶细胞膜上的融合结构域发生融合，使病毒核衣壳穿入宿主细胞。(二)脱衣壳和逆转录病毒进入细胞后包裹在病毒衣壳内的病毒RNA，在与亲环素结合的衣壳蛋白p24的辅助下出胞。这一过程对环胞菌素A敏感。紧接着病毒RNA利用自身逆转酶的RNA依赖的DN
13、A聚合酶和RNA酶活性进行逆转录，最后合成病毒基因组的双链DNA分子(cDNA)。(三)环化cDNA在环化酶的作用下形成以共价或非共价结合的双链环状DNA分子。其中非共价结合的环状DNA是整合到宿主染色体上的形式，抗病毒药对此无效。大多数新合成的病毒DNA以游离、非整合的共价结合的环状DNA形式保留在细胞浆内，它没有转录作用，但有致病理变化作用，抗病毒药对以这种形式存在的病毒有效，可使病毒载量下降。(四)整合在整合酶的作用下，新形成的非共价结合的双股DNA整合人宿主细胞染色体DNA中。这种整合的病毒双股DNA即前病毒。这样感染就持续存在。前病毒DNA存在于宿主细胞DNA中，一般没有病毒蛋白的合
14、成，成为潜伏状态，也可以免受宿主免疫系统的攻击。(五)转录当前病毒被活化而进行自身转录时，病毒DNA在转录酶的作用下形成RNA，一些RNA经拼接而成为病毒mRNA；另一些RNA经加帽加尾成为病毒的子代基因组RNA。(六)翻译与装配病毒利用宿主细胞内的核蛋白体，依据mRNA上各个基因组的遗传信息翻译出所需要的各种病毒蛋白，再在内质网核糖体进行糖化和加工，在蛋白酶作用下裂解，产生子代病毒的蛋白和酶类。Gag蛋白与病毒RNA结合装配成核壳体。 (七)病毒体成熟、出芽病毒颗粒通过芽生方式从胞浆膜释放时获得病毒体的包膜。抗病毒治疗可以直接针对病毒复制的每一个步骤，从而可以中断病毒的复制和传播。三、病毒生
15、物学特征对病程的影响艾滋病病毒感染过程中，不同个体CD4，细胞数的下降速率相差很大，从稳定的长期不进展状态(病程大于10年)到数年内发展为艾滋病。大量的研究表明病毒与宿主之间的相互作用是决定病程进展的关键因素。自1989年成功地从HIV感染者体内分离出HIV以来，人们在实验室对它的复制特性进行了大量的研究，发现从处于不同病程阶段感染者血中分离的原代病毒株的复制速率和原代培养中所获得的病毒量是不同的，提示病毒学因素对于决定病程进展可能是至关重要的，也就促使人们进一步调查和研究HIV的生物学特性，如复制速率、致细胞病变特性以及病毒在细胞培养中的嗜性。研究发现，不仅在不同感染者其病毒的生物学特性不同
16、，病程进展速率不同，SI型病毒感染的个体病程进展较NSI型感染者快。即使在同一个体病程进展过程中，其病毒的生物学特性也会有所改变，可由病程早期的NSI型转变为晚期的SI型。正如HIV的基因会时常发生变异一样，病毒对辅助受体的利用也在不断的变化中，研究表明在病程的早期HIV进入细胞所利用的受体是R5受体，随着病程的进展、宿主细胞识别HIV能力的增强和HIV自身为在宿主细胞内播散及更不受阻的进入细胞而会出现受体利用转移，如利用RSX4或R3RSX4受体。这些变化的物质基础是基因的变异，结果尚不明确但可以想象的是HIV在体内不被清除反而毒性加强，药物受体抑制剂的作用不显著。第三节艾滋病病毒感染导致的
17、人体变化及最终结局一、HIV感染导致的人体变化 人体感染HIV后，即开始了病毒试图在体内生存，机体免疫反应试图清除病毒的两种力量的持续较量。在没有任何有效治疗的情况下，数年或十数年后病毒将战胜机体，病人死亡。(一)病毒在体内的复制HIV在人体内的半衰期为2天，每天产生或清除的病毒量平均约为109。病毒在体内快速复制、播散、破坏细胞，最终战胜免疫系统的抵抗，使机体衰竭。按照病毒复制过程和各个阶段的主要特征将病毒在体内的动态分为以下几个期：1.体内播散期病毒进人体内在2天内到达局部淋巴结，5天内进入血液循环。其结果是导致全身性播散，到达脑部和淋巴组织。2.原发HIV感染期从暴露于HIV到出现症状的
18、时间一般是24周，但是在少数病例可长达10个月。在急性感染的数天内，淋巴结内被激活的淋巴细胞中出现高水平的病毒复制，在很短的几天内出现P24抗原血症和高滴度病毒血症，每毫升血浆中可检出107个病毒RNA分子。CD8+细胞计数上升，并伴有短暂的CD4、细胞计数下降。随着特异性体液免疫应答的出现，病毒血症减轻，突变病毒出现，病毒成为异质群体。免疫应答出现后，血浆中HIVRNA的滴度会下降23个对数级，急性HIV感染的症状也会消失。3.血清转换期用标准第三代EIA试剂检测，通常3周发生HIV抗体阳转。从HIV感染到产生抗体(或血清抗体阳转)称为“窗口期”，95%的HIV抗体都发生在感染后的5.8个月
19、，故一般认为窗口期为6个月。“HIV感染早期”的定义为血清抗体阳转和HIV感染6个月之间的阶段。6个月时病毒载量达到一个“固定值”，如果不进行抗病毒治疗，几年内不会有很大变化。这个固定值和预后有很大关系。早期治疗的目标之一是重新设定固定值，使固定值保持较低水平。临床上的急性感染期包括了HIV在体内的这三个阶段，回顾性的调查发现非典型的症状如：发热、疲乏、咽炎、头痛、腹泻、口腔、食管或生殖器黏膜溃疡、关节痛等会出现。4.无症状感染期这个时期病人无临床症状，体检时无异常，少数可查到“持续性全身性淋巴腺病”(PGL)，定义为肿大的淋巴结至少发生在两处且不是腹股沟淋巴结。这个时期由于细胞外的病毒被滤泡
20、树突状细胞(FDC)捕捉而进人生发中心，细胞内的病毒大部分处于潜伏状态，所以淋巴结中病毒浓度很高。这个时期淋巴组织是病毒的主要藏身处，外周血中的病毒载量相对不高，随着疾病的进程，淋巴结结构被破坏，更多的病毒释放出来。此期相当于临床病程的潜伏期，上述的不典型症状很快消失，患者无临床症状出现。5.艾滋病前期(“ARC”或“B期”)B期症状包括被HIV感染后更常见更严重的症状，但还不是艾滋病的典型症状。此期也即临床的艾滋病相关综合征期，症状包括被HIV感染后更常见、更严重的症状，但还不是艾滋病的典型症状。常见并发症包括鹅口疮、口腔毛状黏膜白斑病、末梢神经紊乱、子宫颈上皮肿瘤、全身性症状(发热、体重减
21、轻)、复发性带状疱疹、特发性血小板减少性紫癜和李斯特菌病。6.艾滋病期当患者出现典型症状时，CD4+细胞计数通常降至200个/l以下，血和淋巴结中的病毒载量又上升到相当高的水平，同时抗病毒CD8+细胞反应减弱。在艾滋病期病人血液中的HIV群体又一次变得相当均一，通常是细胞融合(SI)表型为主，与T细胞嗜性有关。7.艾滋病晚期这个时期指CD4+计数50个/l的病人，若不经治疗平均存活期是1218个月。此即真正意义上的艾滋病(AIDS)期，此期一系列的指征性疾病会在不同的患者身上出现，包括：浸润性宫颈癌、食道、气管、支气管或肺念珠菌病、弥漫性或肺外球孢子菌病、肺外隐球菌病、HIV相关痴呆症、伯基特
22、淋巴瘤、HIV相关的消瘦等等，最后的结局是患者死于并发症。 在这些不同的临床阶段，病毒群依次经历均一性到异质性，又恢复到均一性等特征。晚期病毒以SI表型为主的特征与在宿主中的毒力有关。二、HIV感染的三种临床结局(一)典型进展者在感染早期，其免疫功能未受损害，但在810年内免疫控制能力逐渐下降，最后发展成为艾滋病。(二)快速进展者这个群体的CD4+细胞计数在25年内迅速下降，抗HIV的抗体水平很低，而且该抗体中和HIV的能力也较差，也可能有增强抗体。快速进展者中最显著的特征是HIV感染后一直维持较高的病毒载量，而且分离的HIV有均一性。(三)长期存活者(又称长期不进展者)这些感染者能维持健康状
23、态12年以上，并且CD4+细胞计数维持正常。这些长期存活者在所有感染者中的比例一般在8%10%，目前最长已达17年。这些无症状者可在血友病患者、静脉吸毒者、异性接触者和新生儿中发现。长期存活者常常具有如下特征：病毒载量低(血浆和PBMC)、HIV毒株是相对非致病性毒株、针对个体中现存HIV毒株的抗体不会加重感染、PBMC产生I型细胞因子、CD8+细胞抗病毒反应很强。三、能否从体内彻底清除艾滋病病毒HIV整合至宿主细胞染色体及其高度变异特性为其在宿主体内长期生存奠定了基础。HIV一旦感染即整合到宿主细胞染色体上，除非破坏细胞，否则无法清除细胞内的病毒。同时，由于HIV具有高度变异性，对感染者个体
24、来说，同一感染者在感染的不同阶段、不同组织器官在疾病的同一阶段分离到的毒株核苷酸序列均会有一定差异；对病毒本身而言，这种高度变异性可导致病毒表型的改变，从而改变宿主疾病过程和临床症状，产生耐药株使治疗药物失效，或对疫苗产生逃逸免疫控制使疫苗无效，最终致使HIV长期在体内存活。此外，在某些静止细胞内，HIV-1的复制中止在逆转录阶段，从而产生一个不稳定的、未能完全复制的中间型。最新的研究发现，无症状HIV-1感染者体内CD4+淋巴细胞主要含有大量未整合的HIV-1 DNA，而艾滋病人主要带有整合的HIV-1 DNA。未整合的HIV-1DNA保持其整合能力，在受到细胞内因子激活后，HIV-1 DN
25、A可整合人细胞DNA。目前的治疗药物对于静止细胞内病毒复制不显示抑制作用。因此，静止细胞作为体内HIV-1来源的储藏库，使其长期存活在体内。这些都使彻底清除体内的病毒变得十分困难。然而仔细分析一下病毒感染后的过程可以发现彻底清除病毒并不是一点希望也没有。HIV感染宿主免疫细胞后以每天产生1091010病毒颗粒的高速度进行复制，但是如果宿主免疫功能完整，每天被清除的HIV颗粒约为107109，也就是说每天约有99%以上的病毒颗粒能够被宿主免疫系统清除，人体若能保持这种强大的清除能力，至少可以维持病毒复制与免疫清除的动态平衡。目前，我们还不清楚为何这种动态平衡会随着病程的进展而消失，人们正在努力探索和寻找维持或恢复机体免疫功能的途径与方法，如促使静止细胞内病毒复制然后进行抗病毒治疗。已经有资料显示有可能清除静止细胞内的HIV。 参考资料：1人类免疫缺陷病毒2艾滋病的致病机理责任编辑：王薇